双链核酸环化方法、甲基化测序文库构建方法和试剂盒技术

一种核酸双链环化方法、甲基化测序文库构建方法和试剂盒。本发明专利技术的核酸双链环化方法，包括：提供正向引物和反向引物，均包含一个U碱基，二者的U碱基5

【技术实现步骤摘要】
双链核酸环化方法、甲基化测序文库构建方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及测序
，具体涉及一种双链核酸环化方法、甲基化测序文库构建方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]华大基因的测序平台BGISEQ-500和MGI2000作为一个开放性平台，提供一站式测序操作流程，测序流程清晰明确，不仅提供可选的文库制备系统和样本加载系统，而且支持多种配套文库制备方案，采用优化的联合探针锚定聚合技术(cPAS)和改进的DNA纳米球(DNB)核心测序技术，是行业领先的高通量测序平台之一。
[0003]而此类平台对应的测序文库，在构建时，需要将PCR文库变性为单链，借助桥接寡核苷酸(splint oligo)进行单链DNA的自我环化，最后形成一个闭合的单链环状DNA，再滚环复制成纳米球(DNB)进行测序。该环化过程的效率较低，并非所有的单链DNA都能自我连接成环，且单链这种形状更容易形成二级结构，从而造成最后环化产物的偏向性，特别是对甲基化测序(whole genome bisulfite sequencing，WGBS)这种富含AT碱基的文库，偏本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双链核酸环化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：提供一对用于扩增双链核酸片段的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物上均包含一个U碱基，所述正向引物的U碱基5
’
端上游序列的核苷酸数与所述反向引物的U碱基5
’
端上游序列的核苷酸数相差N个，N是大于等于1的正整数，并且，所述正向引物的U碱基5
’
端上游序列与所述反向引物的U碱基5
’
端上游序列至少部分反向互补；使用所述引物对扩增所述双链核酸片段得到扩增产物，所述扩增产物两端分别包含所述正向引物和反向引物的序列；使用USER酶将所述扩增产物中的U碱基切除，进而形成单核苷酸缺口，从所述缺口至5
’
末端的剩余核酸序列由于结构不稳定而发生链解离，进而在所述扩增产物两端形成部分互补的粘性末端结构；在连接酶作用下，使两端的粘性末端结构互补连接以形成环状双链结构的核酸，其中所述环状双链结构的核酸的一条链闭合，另一条链具有N个核苷酸缺失。2.根据权利要求1所述的核酸双链环化方法，其特征在于，所述N是1-7的任一整数；任选地，所述剩余核酸序列的长度为2-20nt。3.一种甲基化测序文库构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：提供两端分别连接有甲基化接头的双链DNA片段；使用重亚硫酸盐处理所述两端分别连接有甲基化接头的双链DNA片段，使非甲基化的C碱基转换成U碱基；通过PCR扩增重亚硫酸盐处理后的转换产物，使U碱基转换成T碱基，从而获得扩增产物，其中所述PCR扩增使用的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物上均包含一个U碱基，所述正向引物的U碱基5
’
端上游序列的核苷酸数与所述反向引物的U碱基5
’
端上游序列的核苷酸数相差N个，N是大于等于1的正整数，并且，所述正向引物的U碱基5
’
端上游序列与所述反向引物的U碱基5
’
端上游序列至少部分反向互补；使用USER酶将所述扩增产物中的U碱基切除，进而形成单核苷酸缺口，从所述缺口至5
’
末端的剩余核酸序列由于结构不稳定而发生链解离，进而在所述扩增产物两端形成部分互补的粘性末端结构；在连接酶作用下，使两端的粘性末端结构互补连接以形成环状双链结构的核酸，其中所述环状双链结构的核酸的一条链闭合，另一条链具有N个核苷酸缺失。4.根据权利要求3所述的甲基化测序文库构建方法，其特征在于，所述方法还包括：提供基因组DNA，对基因组DNA依次进行打断、末端修复、加A尾和甲基化接头连接得到的甲基化接头连接产物，作为所述两端分别连接有甲基化接头的双链DNA片段；任选地，所述方法还包括：对所述甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐冲，王娟，何长寿，童益琴，杨林峰，高强，
申请(专利权)人：深圳华大基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：