一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法及二级放大的单链DNA制备方法技术

本发明专利技术提供了一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法，属于分子生物学技术领域。所述制备方法包括：以基因识别引物、第一磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料，进行连接反应；连接反应完成后加入Bst DNA聚合酶和dNTP，进行滚环扩增反应，反应温度为45

【技术实现步骤摘要】
一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法及二级放大的单链DNA制备方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，特别涉及一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法及二级放大的单链DNA制备方法。

技术介绍

[0002]荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一种基于DNA或DNA/RNA双链互补性质的核酸分子识别技术。荧光原位杂交可应用于细胞中RNA分子的定位与表达丰度的检测，是生物学实验与临床的疾病检测中常用的检测与分析方法。尽管之前的研究已经报道了关于FISH相关的检测技术，也表现出了良好的稳定性与检出率。但从综合性能方面来说，以前的FISH不论在成本、步骤复杂性和信号强度方面都表现出或多或少的缺点。
[0003]现有的几种FISH放大技术，如分支DNA，HCR，ClampFISH，SABER等，均存在一定局限性，具体如下：
[0004]1)分支DNA也叫bDNA(branch DNA)，是一种通过DNA合成仪合成的一种支链DNA，在DNA化学合成过程中在已经合成的一个臂(茎)连接在5
′
末端的分支点上引入支链单体修饰来合成多个其他臂(枝)连接在3
′
末端继续合成。虽然这种方法被广泛应用，但从费用方面考虑，由于需要合成分支状的DNA寡聚核苷酸，成本较高。
[0005]2)HCR(Hybridization Chain Reaction)杂交链式反应，是利用互补配对的发卡结构的荧光探针分子进行杂交反应来放大荧光信号；但要设计相互不干扰的多重发卡结构的荧光探针具有一定的难度，而且由于放大的信号有限。
[0006]3)CIampFISH技术利用一种click化学反应形成环形DNA后，通过多轮处理后逐级放大的一种方法[3]；但ClampFISH合成在DNA的两端都合成有click修饰的引物，合成费用也非常高。
[0007]4)SABER是一种通过PER扩增的来实现信号放大的方法，在体外扩增单链DNA，对荧光结合序列进行重复延伸，使其在拷贝数量上得到放大。但这种方法在编码能力上具有一定的限制，而且也需要合成一种iso
‑
dG或so
‑
dC修饰和3
′
端修饰的发卡状DNA。
[0008]以上方法在性能上都各自存在着一些局限性。要实现灵敏、低成本地实现RNA信号检测，对FISH检测提出了新的挑战。

技术实现思路

[0009]为了解决现有FISH放大技术成本高、步骤复杂、信号强度弱的技术问题，本专利技术提供了一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法，该方法具有经济实用、步骤简单、稳定和灵敏度高的优点。
[0010]本专利技术还提供了一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA制备方法。
[0011]本专利技术通过以下技术方案实现：
[0012]本专利技术实施例提供一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法，所述制备方法包括：
[0013]以基因识别引物、第一磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料，进行连接反应；
[0014]连接反应完成后加入Bst DNA聚合酶和dNTP，进行滚环扩增反应，反应温度为45
‑
55℃，反应时间为1
‑
3h，获得用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA；
[0015]其中，所述第一磷酸化环化引物包含片段C，所述C的局部片段与第一荧光探针的核酸片段核苷酸序列相同；
[0016]或者，所述C的局部片段与二级放大单链DNA的局部片段核苷酸序列相同。
[0017]可选的，所述以基因识别引物、第一磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料，进行连接反应，具体包括：
[0018]将基因识别引物、第一磷酸化环化引物、DNA连接酶缓冲液和退火缓冲液混合，90
‑
95℃热处理3
‑
5min，以0.1
‑
0.4℃/min的冷却速度冷却至25
‑
37℃，后加入DNA连接酶进行连接反应，反应温度为25
‑
37℃，反应时间为4
‑
12h。
[0019]可选的，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
[0020]可选的，所述基因识别引物的一端包含片段A，另一端包含片段B1和B2，所述A与待测DNA或待测RNA的局部片段碱基互补；
[0021]所述第一磷酸化环化引物的两端分别为片段B1
′
和B2
′
，所述B1
′
和所述B2
′
之间的序列包含所述C，所述B1与所述B1
′
碱基互补，所述B2与所述B2
′
碱基互补。
[0022]可选的，所述基因识别引物中：
[0023]所述A具有如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：10中任意一项所示的核苷酸序列；
[0024]所述B1具有如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列；
[0025]所述B2具有如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；
[0026]所述第一磷酸化环化引物中：
[0027]所述B1
′
具有如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；
[0028]所述B2
′
具有如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列；
[0029]所述C具有如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。
[0030]基于同一专利技术构思，本专利技术实施例还提供一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA，所述单链DNA一端包含片段A，另一端包含若干个片段C
′
，所述C
′
与DNA片段C碱基互补，所述A具有如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：10中任意一项所示的核苷酸序列，所述C具有如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。
[0031]基于同一专利技术构思，本专利技术实施例还提供一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA制备方法，所述方法包括：
[0032]以二级放大识别引物、第二磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料，进行二级放大连接反应；
[0033]二级放大连接反应完成后加入Bst DNA聚合酶和dNTP，进行二级放大滚环扩增反应，反应温度为45
‑
55℃，反应时间为1
‑
3h，获得用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA。
[0034]可选的，所述以二级放大识别引物、第二磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料，进行二级放大连接反应，具体包括：
[0035]以二级放大识别引物、第二磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料，90
‑
95℃热处理3
‑
5min，以0.1
‑
0.4℃/min的冷却速度冷却至25
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：以基因识别引物、第一磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料，进行连接反应；连接反应完成后加入Bst DNA聚合酶和dNTP，进行滚环扩增反应，反应温度为45
‑
55℃，反应时间为1
‑
3h，获得用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA；其中，所述第一磷酸化环化引物包含片段C，所述C的局部片段与第一荧光探针的核酸片段核苷酸序列相同；或者，所述C的局部片段与二级放大单链DNA的局部片段核苷酸序列相同。2.根据权利要求1所述的一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法，其特征在于，所述以基因识别引物、第一磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料，进行连接反应，具体包括：将基因识别引物、第一磷酸化环化引物、DNA连接酶缓冲液和退火缓冲液混合，90
‑
95℃热处理3
‑
5min，以0.1
‑
0.4℃/min的冷却速度冷却至25
‑
37℃，后加入DNA连接酶进行连接反应，反应温度为25
‑
37℃，反应时间为4
‑
12h。3.根据权利要求1所述的一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法，其特征在于，所述基因识别引物的一端包含片段A，另一端包含片段B1和B2，所述A与待测DNA或待测RNA的局部片段碱基互补；所述第一磷酸化环化引物的两端分别为片段B1
′
和B2
′
，所述B1
′
和所述B2
′
之间的序列包含所述C，所述B1与所述B1
′
碱基互补，所述B2与所述B2
′
碱基互补。4.根据权利要求3所述的一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法，其特征在于，所述基因识别引物中：所述A具有如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：10中任意一项所示的核苷酸序列；所述B1具有如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列；所述B2具有如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；所述第一磷酸化环化引物中：所述B1
′
具有如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；所述B2
′
具有如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列；所述C具有如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。5.一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA，其特征在于：所述单链DNA一端包含片段A，另一端包含若干个片段C
′
，所述C
′
与DNA片段C碱基互补，所述A具有如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：10中任意一项所示的核苷酸序列，所述C具有如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。6.一种用于核酸原位杂交信号二级放大...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨杰，吴飒，曹冬建，奚彩丽，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：