一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，旨在提供一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，该方法不仅提取率、除蛋白率、纯度大幅度提高；其技术方案：将铁皮石斛鲜茎在烘干，粉碎；将铁皮石斛粉末按照料液质量体积比1g:15‑30ml溶解于水中，在50‑60℃，提取2次，每次1‑3h，将两次提取液合并，用过滤，以6000‑8000r/min离心10‑15min，取上清液浓缩至20‑40mL；加入95％乙醇，摇匀，4℃下冷藏8‑12h后离心，收集沉淀并冷冻干燥2天，研磨得到白色粗多糖粉末，用热水溶解得到0.5‑5mg/mL的粗多糖溶液；加入乙醇‑硫酸铵混合溶液静置分层，在15‑55℃萃取，保留下相物质，在60℃下减压浓缩再加入乙醇过夜，离心收集沉淀进行冷冻干燥，得到铁皮石斛纯多糖。

【技术实现步骤摘要】
一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法
本专利技术公开了一种分离纯化铁皮石斛多糖的方法，具体地说，是一种一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法；属于提取

技术介绍
铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)作为一种传统名贵的中药材，是一种具有高药用价值的食用植物，其主要活性成分有多糖、生物碱、类黄酮、多酚、微量元素和氨基酸等，其中多糖含量最高，2020版《中国药典》记载铁皮石斛中多糖含量不低于25％。铁皮石斛多糖具有降血糖、护肝、抑菌、抗肿瘤、抗骨质疏松、保护肠胃、抗氧化和增强免疫力等功效。目前铁皮石斛粗多糖主要以水提法提取，一般会含有蛋白质和色素等杂质。目前关于石斛多糖中水提脱蛋白的方法较多是蛋白质变性法与酶解法，但这些方法存在操作复杂、重复次数多、脱蛋白率不高、多糖损失率大等缺点。传统石斛多糖的除去蛋白质的方法中最常使用Sevag法除去多糖中的蛋白质。该方法用到氯仿、正丁醇以4:1的体积比混合液，重复3次以上来去除多糖溶液中的蛋白质。氯仿是一种有机化合物，无色、有甜味、易挥发的液体。在医疗上用作麻醉剂，氯仿有中度毒性，可经消化道、呼吸道、皮肤进入机体。其主要急性毒性作用是对中枢神经系统有麻醉作用，对眼及皮肤有刺激作用，并能损害心脏、肝脏、肾脏，另外可脱脂。氯仿的急性中毒表现为头痛、头晕、乏力、恶心、呕吐。患者先兴奋后麻醉，出现肝肾损伤等，严重者可因呼吸麻痹、心室纤颤而死亡。皮肤若接触氯仿，可出现红斑、水肿、水疱、冻伤等。长期接触患者主要出现肝脏损害，并伴有消化不良、抑郁、失眠、共济失调等。在动物试验发现，氯仿有高胚胎毒性和轻度致畸性，可诱导小白鼠发生肝癌。而正丁醇属低毒类。麻醉作用比丙醇要强，与皮肤多次接触可导致出血和坏死。对人的毒性较乙醇约大三倍。其蒸气刺激眼、鼻、喉部。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，该方法避免了使用有毒的氯仿纯化粗多糖，不仅提取率、除蛋白率、纯度大幅度提高，纯度可以达到90-95％。为此本专利技术提供的技术方案是这样的：一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，依次包括下述步骤：1)将铁皮石斛鲜茎在40-50℃烘干，粉碎至100-300目；2)将铁皮石斛粉末按照料液质量体积比1g:15-30ml溶解于去离子水中，在50-60℃，提取2次，每次1-3h，合并提取液，过滤后收集上清液，以6000-8000r/min离心10-15min，取上清液，用50-60℃浓缩至提取液总体积的0.015-0.025倍；3)加入80-160mL的95％乙醇，摇匀，4℃下冷藏8-12h，取出后在4500-5000r/min离心，收集沉淀并冷冻干燥2天，研磨得到白色粗多糖粉末，在用55-65℃水溶解得到0.5-5mg/mL浓度的粗多糖溶液；4)向粗多糖溶液加入乙醇-硫酸铵混合溶液静置分层，在15-55℃萃取，萃取结束后将两相分离，保留下相物质，即为浸提液；5)在60℃下减压浓缩浸提液，再加入4倍体积70-90％乙醇过夜，离心收集沉淀进行冷冻干燥，得到铁皮石斛纯多糖。进一步的，上述的双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，所述的乙醇-硫酸铵混合溶液中乙醇的质量浓度为21-30％，硫酸铵的质量浓度为17-21％。进一步的，上述的双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，所述乙醇-硫酸铵混合溶液中乙醇的添加量为7.5g/30g，硫酸铵的添加量为5.64g/30g。进一步的，上述的双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，步骤)4具体为：将步骤3)中的粗多糖溶液加入乙醇-硫酸铵，置于漩涡混合器上于室温下混合，静置至上下相体积不再发生变化，将双水相体系两相分离并进行透析48h。进一步的，上述的双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，步骤5)中离心收集沉淀的方法为在浸提液中加入浓度为95％的乙醇搅拌摇匀，4℃冷藏12h，取出后5000r/min离心10min，保留沉淀。进一步的，上述的双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，步骤4)所述乙醇-硫酸铵混合溶静置时间4-6min。与现有技术相比，本专利技术提供的技术方案具有如下技术效果:1、本专利技术提供的技术方案乙醇-无机盐组成的双水相体系，除去石斛多糖中的蛋白质。实现了石斛多糖的高效、安全提取显著提高了多糖提取效率，为铁皮石斛多糖的纯化及其实际生产应用提供实验依据。2、本专利技术提供的技术方案分离纯化铁皮石斛多糖，避免了使用有毒的氯仿纯化粗多糖，不仅提取率、除蛋白率、纯度大幅度提高，纯度可以达到90-95％。附图说明图1为乙醇-硫酸铵双水相相图；图2为硫酸铵浓度、乙醇浓度交互多糖萃取率的响应面与等值线图；图3为硫酸铵浓度、萃取温度交互多糖萃取率的响应面与等值线图；图4为乙醇浓度、萃取温度交互多糖萃取率的响应面与等值线图；图5为硫酸铵浓度、乙醇浓度交互除蛋白率的响应面与等值线图；图6为硫酸铵浓度、萃取温度交互除蛋白率的响应面与等值线图；图7为乙醇浓度、萃取温度交互除蛋白率的响应面与等值线图。具体实施方式下面结合具体实施方式，对本专利技术的权利要求做进一步的限制，但不构成对本专利技术的任何限制，任何人在本专利技术权利要求范围内所做出的的有限次的修改，仍在本专利技术的权利要求保护范围之内。本专利技术实施例用浙江产地青源堂公司的铁皮石斛鲜条。实施例1(1)一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，铁皮石斛鲜茎50℃烘干，用中药粉碎机粉碎至200目；准确称取铁皮石斛粉末10.0g，按照1:25料液质量体积比加入去离子水250mL，搅拌均匀；溶液温度保持在55-60℃，提取2次，每次1h；将2次提取液合并，纱布过滤，以7500r/min离心10min，取上清液得到澄清提取液，用旋转蒸发仪60℃浓缩至30mL，再加入120mL的95％乙醇，摇匀，4℃下冷藏12h，取出后在5000r/min离心15min，弃上清液留沉淀，将沉淀进行冷冻干燥2天，研磨白色固体得到粗多糖粉末。将铁皮石斛粗多糖用去离子水配制成0.5mg/mL的溶液，加热搅拌使其充分溶解，放置至室温(25℃)备用。(2)固定乙醇-硫酸铵双水相体系质量为30.0g。在50mL离心管中分别加入5.64g的硫酸铵和7.5g乙醇溶液，加入16.86g浓度为0.5mg/mL的铁皮石斛粗多糖提取液，置于漩涡混合器上于室温下混合，静置至上下相体积不再发生变化，萃取结束后将两相分开，保留下相。(3)用透析袋透析(1000Da)48h，以除去硫酸铵。随后在60℃下减压浓缩，加入4倍体积95％乙醇过夜，离心收集沉淀进行冷冻干燥，得到铁皮石斛纯多糖。其中，所得铁皮石斛多糖萃取率为94.17％，除蛋白率为92.76％，粗多糖纯度为85.20％，乙醇-硫酸铵双水相体系纯化后多糖纯度为95.35％。实施例2(1)一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，其特征在于：依次包括下述步骤：/n1)将铁皮石斛鲜茎在40-50℃烘干，粉碎至100-300目；/n2)将铁皮石斛粉末按照料液质量体积比1g:15-30ml溶解于去离子水中，在50-60℃，提取2次，每次1-3h，合并提取液，过滤后收集上清液，以6000-8000r/min离心10-15min，取上清液，用50-60℃浓缩至提取液总体积的0.015-0.025倍；/n3)加入80-160mL的95％乙醇，摇匀，4℃下冷藏8-12h，取出后在4500-5000r/min离心，收集沉淀并冷冻干燥2天，研磨得到白色粗多糖粉末，在用55-65℃水溶解得到0.5-5mg/mL浓度的粗多糖溶液；/n4)向粗多糖溶液加入乙醇-硫酸铵混合溶液静置分层，在15-55℃萃取，萃取结束后将两相分离，保留下相物质，即为浸提液；/n5)在60℃下减压浓缩浸提液，再加入4倍体积70-90％乙醇过夜，离心收集沉淀进行冷冻干燥，得到铁皮石斛纯多糖。/n

【技术特征摘要】
1.一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，其特征在于：依次包括下述步骤：
1)将铁皮石斛鲜茎在40-50℃烘干，粉碎至100-300目；
2)将铁皮石斛粉末按照料液质量体积比1g:15-30ml溶解于去离子水中，在50-60℃，提取2次，每次1-3h，合并提取液，过滤后收集上清液，以6000-8000r/min离心10-15min，取上清液，用50-60℃浓缩至提取液总体积的0.015-0.025倍；
3)加入80-160mL的95％乙醇，摇匀，4℃下冷藏8-12h，取出后在4500-5000r/min离心，收集沉淀并冷冻干燥2天，研磨得到白色粗多糖粉末，在用55-65℃水溶解得到0.5-5mg/mL浓度的粗多糖溶液；
4)向粗多糖溶液加入乙醇-硫酸铵混合溶液静置分层，在15-55℃萃取，萃取结束后将两相分离，保留下相物质，即为浸提液；
5)在60℃下减压浓缩浸提液，再加入4倍体积70-90％乙醇过夜，离心收集沉淀进行冷冻干燥，得到铁皮石斛纯多糖。


2.根据权利要求1所述的双水相萃取分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小辉，卫梦尧，丁金龙，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44