用于检测埃立克体的EvaGreen荧光定量PCR试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术属于埃立克体(Ehrlichia)检测技术领域，涉及用于检测埃立克体的Eva Green荧光定量PCR试剂盒和检测方法。本发明专利技术基于反刍动物埃立克体(Ehrlichia ruminantium)16S RNA提供了Eva Green荧光定量PCR引物，其如SEQ ID NOs 1

【技术实现步骤摘要】
用于检测埃立克体的Eva Green荧光定量PCR试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于埃立克体(Ehrlichia)检测
，具体而言涉及通过 Eva Green荧光定量PCR检测埃立克体的试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]埃立克体属(Ehrlichia)细菌属于α
‑
变形菌纲(α
‑
Proteobacteria)立克次体目(Rickettsiales)的无形体科(Anaplasmataceae)。埃立克体在自然界中借助节肢动物媒介和脊椎动物宿主而存在，能引起人或动物埃立克体病。
[0003]例如，反刍动物埃立克体(Ehrlichia ruminantium)是一类专性细胞内寄生的革兰氏阴性细菌。由反刍动物埃立克体引起的疾病统称心水病，是一种人畜共患的自然疫源性疾病，这种疾病几乎分布在撒哈拉沙漠以南非洲的所有地区和加勒比海的一些岛屿上，并传播至其他国家，其传播者主要是钝眼蜱属的希伯来钝眼蜱和美洲钝眼蜱。该病是牛、绵羊、山羊及其他反刍动物最重要的传染病之一，临床症状包括发热、食欲不振、呼吸困难和猝死，死亡率高达80％。心水病的流行与传播媒介蜱的消长和活动规律相一致，具有明显的地方性和季节性。心水病不仅威胁农牧业健康发展和食品安全，对流行国家造成了巨大的经济损失，而且被认为是一种潜在的新出现的人畜共患病。
[0004]早期诊断可以有效控制埃立克体病。例如反刍动物心水病的传统诊断方法是基于临床症状的血液涂片镜检和血清学检测，这些检测方法耗时较长，难以适应快速诊断和控制疫情的需要，也不适合蜱样本内的反刍动物检测。随着分子检测技术的快速发展，常规PCR、套式PCR(nestedPCR)、LAMP和荧光定量PCR(qPCR)等检测技术已应用于反刍动物血液和蜱体内反刍动物埃立克体的检测。这些检测方法各有优缺点，常规PCR 方法特异性和敏感性较低，扩增时容易产生假阳性；LAMP技术污染的可能性较大，条件控制要求比PCR更严格；套式PCR方法耗时、污染风险高。
[0005]埃立克体的分子检测主要集中在pCS20、16S RNA和map1等基因序列或基因家族。如何针对上述基因序列，比如16S RNA序列建立一种检测方法，以便快速、准确的检测埃立克体，埃立克体病的防控及分子流行病学研究提供技术支持和试验依据，是本领域急需解决的技术问题。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术的目的是针对埃立克体，尤其是反刍动物埃立克体16S RNA高度保守和特异的基因片段设计特异性引物，将Eva Green荧光定量PCR技术应用于反刍动物埃立克体的检测和定量分析中，建立Eva Green荧光定量PCR检测试剂盒和检测方法，以便快速、准确地检测埃立克体，尤其是反刍动物埃立克体。
[0007]本专利技术的目的及其技术问题的解决是通过以下技术方案实现的。
[0008]一方面，本专利技术提供了一种用于检测埃立克体的Eva Green荧光定量 PCR引物，该
引物选自下述引物对中的一对：
[0009]正向引物F1：5
’‑
ACT CTAGTG GYCCAC GTC CA
‑
3'(SEQ ID NO.1)，
[0010]反向引物R1：5
’‑
TAG TCT CTG GTACAGCAT TG
‑
3'(SEQ ID NO.2)；
[0011]正向引物F2：5
’‑
CAG GAT ATG GAG GGA ACC GTC
‑
3'(SEQ ID
ꢀꢀ
NO.3)，
[0012]反向引物R2：5
’‑
CTC CTG GTT TGA CAGTTG TA
‑
3'(SEQ ID NO.4)；以及
[0013]正向引物F3：5
’‑
CAG GATATG GAG GGAACC GTC
‑
3'(SEQ ID NO. 5)，
[0014]反向引物R3：5
’‑
GTT GTATAA GGTATTTCA GG
‑
3'(SEQ ID NO.6)。
[0015]另一方面，本专利技术提供了用于检测埃立克体的Eva Green荧光定量 PCR试剂盒，包含上述引物对之一。
[0016]在第三方面，本专利技术提供了用于检测埃立克体的Eva Green荧光定量PCR方法，包括以下步骤：
[0017](1)DNA模板提取：提取待测样品中的DNA；
[0018](2)Eva Green荧光定量PCR：以步骤(1)提取的DNA为模板，并采用权利要求1所述引物对之一，进行Eva Green荧光定量PCR；
[0019](3)分析Eva Green荧光定量PCR扩增产物；
[0020]该方法不以疾病的诊断和/或治疗为目的。
[0021]在本专利技术第三方面的实施方案中，Eva Green荧光定量PCR方法的反应体系以25μL计包含：
[0022]DNA模板：2.0μL，
[0023]SsoFast EvaSupermix(2x)：12.5μL，
[0024]正向引物：0.25
‑
2.0μL，
[0025]反向引物：0.25
‑
2.0μL，
[0026]灭菌去离子水补至25μL。
[0027]在另一实施方案中，Eva Green荧光定量PCR方法的反应体系以25 μL计包含：
[0028]DNA模板：2.0μL，
[0029]SsoFast EvaSupermix(2x)：12.5μL，
[0030]正向引物：0.75μL，
[0031]反向引物：0.75μL，
[0032]灭菌去离子水补至25μL。
[0033]在本专利技术第三方面的实施方案中，引物优选为：正向引物F3：5
’‑
CAGGATATG GAG GGAACC GTC
‑
3'(SEQ ID NO.5)，反向引物R3：5
’‑
GTTGTATAAGGTATTTCAGG
‑
3'(SEQ ID NO.6)。
[0034]在本专利技术第三方面的实施方案中，在Eva Green荧光定量PCR方法的反应体系中，正向引物和反向引物的终浓度优选均为0.6pmol/μL。
[0035]在本专利技术第三方面的另一实施方案中，Eva Green荧光定量PCR的反应条件为：50℃2min，95℃10min预变性；然后95℃变性15s，51
‑
60℃延伸1min并收集荧光，共40个循环，优选52℃下延伸1min。
[0036]在本专利技术第三方面的具体实施方案中，步骤(3)中以出现典型扩增和溶解曲线为阳性，表明检测的样品中存在埃立克体，反之，若不出现典型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测埃立克体(Ehrlichia)的Eva Green荧光定量PCR引物，其特征在于，该引物选自下述引物对中的一对：正向引物F1：5
’‑
ACT CTA GTG GYCCAC GTC CA
‑
3'(SEQ ID NO.1)，反向引物R1：5
’‑
TAG TCT CTG GTA CAGCATTG
‑
3'(SEQ ID NO.2)；正向引物F2：5
’‑
CAG GAT ATG GAG GGA ACC GTC
‑
3'(SEQ ID NO.3)，反向引物R2：5
’‑
CTC CTG GTT TGA CAGTTG TA
‑
3'(SEQ ID NO.4)；和正向引物F3：5
’‑
CAG GAT ATG GAG GGAACC GTC
‑
3'(SEQ ID NO.5)，反向引物R3：5
’‑
GTT GTA TAA GGT ATTTCA GG
‑
3'(SEQ ID NO.6)。2.用于检测埃立克体的Eva Green荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的引物。3.权利要求1所述引物或权利要求2所述试剂盒在检测埃立克体中的应用，所述应用不以疾病诊断和/或治疗为目的。4.用于检测埃立克体的Eva Green荧光定量PCR方法，其特征在于包括以下步骤：(1)DNA模板提取：提取待测样品中的DNA；(2)Eva Green荧光定量PCR：以步骤(1)提取的DNA为模板，并采用权利要求1所述引物对之一，进行Eva Green荧光定量PCR；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：王素华，吕继洲，吴绍强，袁淑辉，蔡军，帅江冰，
申请(专利权)人：温州海关综合技术服务中心，
类型：发明
国别省市：