单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法及其应用，涉及生物检测技术领域。本发明专利技术提供的单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，首先分别提取单增李斯特菌标准品、待测样品和非目标菌株的DNA，然后将得到的DNA进行微滴数字PCR扩增得到反应液，最后对反应液进行检测和分析，其中微滴数字PCR扩增的探针具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，引物具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，该引物对单增李斯特菌的扩增具有较好的特异性，能对食品中单增李斯特菌含量进行准确测定。本发明专利技术的检测方法简单，周期短，灵敏度高、精密度高、稳定性良好，且与大肠杆菌等均无交叉反应。交叉反应。交叉反应。

【技术实现步骤摘要】
单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其是涉及一种单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]微滴数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)是新型核酸定量检测技术，与传统定量PCR(qPCR)技术不同，微滴数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数，检测极限可达单拷贝，具有比传统RT
‑
PCR更加出色的灵敏度、特异性和精确性。微滴数字PCR技术在痕量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面具有极大的优势。
[0003]单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)，简称单增李斯特菌(L.M)，属于李斯特菌属，是一种人畜共患病的致病菌。其引起的主要疾病包括细菌性脑膜炎、败血症、心肌炎、骨髓炎，甚至导致孕妇流产以及新生儿感染。单增李斯特菌的主要特征之一是可在低温下生长，在零下20℃的环境下仍能存活1年，0～45℃都能生存，在冰箱冷藏室4～6℃的温本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：分别提取单增李斯特菌标准品、待测样品和非目标菌株的DNA，然后将得到的DNA进行微滴数字PCR扩增得到反应液，最后对反应液进行检测和分析；所述微滴数字PCR扩增的引物具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述微滴数字PCR扩增的探针具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于，所述单增李斯特菌标准品包括质粒；优选地，所述质粒包括单增李斯特菌被所述引物所扩增的序列。3.根据权利要求1所述的单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于，所述非目标菌株包括金黄色葡萄球菌、铜绿芽孢杆菌、沙门氏菌或大肠杆菌中的至少一种。4.根据权利要求1所述的单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于，所述微滴数字PCR的反应体系包括：ddPCR Supermix for Probes 9
‑
11μL、上游引物1.8
‑
2.2μL、下游引物1.8
‑
2.2μL、探针0.9
‑
1.1μL、模板DNA 0.9
‑
1.1μL和双蒸水3.6
‑
4.4μL；优选地，所述微滴数字PCR的反应体系包括：ddPCR Supermix for Probes 10μL、上游引物2μL、下游引物2μL、探针1μL、模板DNA 1μL和双蒸水4μL。5.根据权利要求4所述的单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于，所述反应体系中，上游引物、下游引物和...

【专利技术属性】
技术研发人员：张红星，谢远红，章若曦，张帅，金君华，刘慧，刘文博，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：