【技术实现步骤摘要】
玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒
[0001]本专利技术属于检测
，尤其涉及一种玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒。
技术介绍
[0002]目前，密执安棒形杆菌内布拉斯加亚种引起玉米内州萎蔫病，可导致玉米高达44％的损失，是玉米上重要的细菌性病原物，也是我国重点关注的检疫性病原物。Cmn首先在美国内布拉斯加州中部发现，后逐步扩展至美国多州和加拿大部分地区，我国尚未有报道。Cmn主要通过种子传带进行远距离传播，利用GRAP模型预测显示，在我国大部分玉米种植区均适合定植。尽管我国玉米产量连续多年稳定在2亿吨以上，但随着国内工业消费需求及饲料消费需求激增，每年仍需大量进口玉米。随着玉米进口贸易的发展，Cmn传入中国风险剧增，一旦入侵将严重威胁我国玉米生产，影响我国粮食生产安全。因此，建立并掌握一种准确、快速的检测方法对于有效监控Cmn扩散情况至关重要。
[0003]目前，针对Cmn的检测主要集中在传统分离培养、酶联免疫检测及常规分子生物学检测上。分离培养及血清学检测耗时较长、操作复杂且灵...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒包括：正向引物SEQ ID NO：1；反向引物SEQ ID NO：2；以及探针SEQ ID NO：3；靶标序列为SEQ ID NO：4。2.一种构建如权利要求1所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒的玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法，其特征在于，所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法包括：步骤一，利用NA培养基活化菌株，接种环刮板收集菌体，提取细菌DNA，核酸测定仪验证提取效果，于
‑
20℃保存备用；步骤二，进行引物探针设计与合成，进行引物筛选与体系建立；利用灭菌ddH2O将确定的最低检测浓度DNA稀释，进行最佳引物组合的荧光RAA检测，测定荧光RAA检测方法的灵敏度；步骤三，验证荧光RAA检测方法的特异性；模拟样品及真实样品检测效果验证，即可得玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒。3.如权利要求2所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法，其特征在于，步骤一中，所述菌株活化包括：于28℃，活化48h。4.如权利要求2所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法，其特征在于，步骤二中，所述进行引物探针设计与合成包括：(1)分析C.michiganensis近缘亚种间纤维素酶基因序列差异，选取CelB序列为模板设计引物和探针；(2)参照Genbank序列HE614873，设计引物cmn1、cmn2扩增靶标序列，利用BLAST将cmn1/cmn2序列与全数据库序列比对，确定引物组合是否100％识别Cmn菌株，且与其他序列数据不匹配；(3)若引物组合100％识别Cmn菌株，且与其他序列数据不匹配，则以Cmn DNA为模板，利用引物cmn1/cmn2扩增目的序列，并将PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳割胶回收，进行克隆测序；(4)参照RAA原理，设计正向引物1F、2F、3F、4F、5F、6F、7F，反向引物1R、2R、3R、4R、5R、6R、7R和探针P。5.如权利要求4所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述扩增包括：反应体系为50μL体系，包括：2
×
Taq PCR StarMix with Loading Dye 25μL，10μM的(cmn1/cmn2)2μL，DNA模板2μL，ddH2O 19μL；扩增条件为94℃3min；94℃30s，62℃30s，72℃45s，35个循环；72℃延伸5min下。6.如权利要求2所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法，其特征在于，步骤二中，所述进行引物筛...
【专利技术属性】
技术研发人员：单长林，李孝军，周圆，季文彬，
申请(专利权)人：舟山海关综合技术服务中心，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。