CRISPRi在高通量代谢工程中的应用制造技术

本公开描述了用于体外高通量DNA组装反应的方法、组合物和试剂盒。本公开进一步描述了模块化CRISPR DNA构建体，所述模块化CRISPR DNA构建体包括模块化插入DNA部分，所述模块化插入DNA部分侧接有包括预先验证的CRISPR原间隔子/原间隔子邻近基序序列组合的克隆标签区段。还公开了CRISPRi和CRISPRa的高通量方法。段。还公开了CRISPRi和CRISPRa的高通量方法。段。还公开了CRISPRi和CRISPRa的高通量方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CRISPRi在高通量代谢工程中的应用
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2018年8月15日提交的美国临时申请第62/764,672号的优先权的权益，所述美国临时申请出于所有目的通过全文引用的方式并入在此，包含所有描述、参考文献、附图和权利要求。
[0003]政府资助
[0004]本专利技术是根据DARPA授予的协议号HR0011
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0014在政府支持下进行的。政府拥有本专利技术的某些权利。
[0005]关于序列表的声明
[0006]与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本并且在此通过引用的方式并入本说明书。含有序列表的文本文件的名称是ZYMR_030_01WO_SeqList_ST25.txt。文本文件为799kb、创建于2019年8月14日并且通过EFS
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Web以电子方式提交。


[0007]本公开涉及用于在体外进行引导的基因序列编辑的系统、方法和组合物。本公开尤其描述了使用引导的序列编辑复合物用于改进的DNA克本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于调节宿主细胞基因的表达的重组模块化CRISPR DNA构建体，所述构建体包括CRISPR多克隆位点，所述多克隆位点包括：a)至少两个不同的克隆标签(cTAG)，其中每个cTAG包括：i)一或多个经过验证的CRISPR着陆位点，每个经过验证的CRISPR着陆位点包括与原间隔子邻近基序PAM可操作地连接的原间隔子序列；其中所述经过验证的CRISPR着陆位点中的至少一个在所述模块化CRISPR DNA构建体中是独特的；以及b)一或多个DNA插入部分；i)其中所述不同的cTAG中的每个cTAG围绕所述一或多个DNA插入部分中的每个DNA插入部分分布在侧翼位置；其中所述构建体进一步包括：c)第一核酸，所述第一核酸对催化灭活CRISPR酶进行编码；d)第二核酸，所述第二核酸对能够将(c)的所述催化灭活CRISPR酶募集到DNA靶位点的引导RNA进行编码。2.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述模块化CRISPR DNA构建体包括第一复制起点。3.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述模块化CRISPR DNA构建体包括多于一个复制起点。4.根据权利要求2所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述模块化CRISPR DNA构建体包括第一复制起点和第二复制起点。5.根据权利要求2所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第一复制起点能够维持大肠杆菌中的质粒。6.根据权利要求4或5所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第二复制起点能够维持谷氨酸棒状杆菌中的质粒。7.根据权利要求2所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第一复制起点能够维持大肠杆菌中的质粒，第二复制起点能够维持酿酒酵母中的质粒，并且第三复制起点能够维持谷氨酸棒状杆菌中的质粒。8.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述模块化CRISPRDNA构建体包括针对可选择标志物进行编码的插入部分。9.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中至少一个复制起点包括在所述CRISPR多克隆位点内的插入部分内。10.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第一核酸包括在所述CRISPR多克隆位点内的插入部分内。11.根据权利要求10所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中包括所述第一核酸的所述插入部分进一步包括可选择标志物。12.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第二核酸包括在所述CRISPR多克隆位点内的插入部分内。13.根据权利要求12所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中包括所述第二核酸的所述插入部分进一步包括可选择标志物。14.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第一核酸和所述第
二核酸各自包括在所述CRISPR多克隆位点内的其自身的插入部分内。15.根据权利要求14所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中包括所述第一核酸和所述第二核酸的所述插入部分各自包括可选择标志物。16.根据权利要求15所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中包括所述第一核酸的所述插入部分中包括的所述可选择标志物和包括所述第二核酸的所述插入部分中包括的所述可选择标志物是不同的。17.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第一核酸和所述第二核酸包括在所述CRISPR多克隆位点内的同一插入部分内。18.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第一核酸与启动子可操作地连接。19.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第一核酸与终止子可操作地连接。20.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第二核酸与启动子可操作地连接。21.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第二核酸与终止子可操作地连接。22.根据权利要求18和20中任一权利要求所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述启动子是异源启动子。23.根据权利要求18和20中任一权利要求所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述启动子是组成型启动子。24.根据权利要求18和20中任一权利要求所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述启动子是诱导型启动子。25.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第一核酸对与转录激活蛋白翻译融合的催化灭活CRISPR酶进行编码。26.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第一核酸对与转录灭活蛋白翻译融合的催化灭活CRISPR酶进行编码。27.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第一核酸对与转录阻遏物翻译融合的催化灭活CRISPR酶进行编码。28.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述构建体进一步包括(e)第三核酸，所述第三核酸对在被表达时能够将自身与所述催化灭活CRISPR酶连接的转录激活蛋白进行编码。29.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述构建体进一步包括(e)第三核酸，所述第三核酸对在被表达时能够将自身与所述催化灭活CRISPR酶连接的转录灭活蛋白进行编码。30.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述构建体进一步包括(e)第三核酸，所述第三核酸对在被表达时能够将自身与所述催化灭活CRISPR酶连接的转录阻遏蛋白进行编码。31.根据权利要求28所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述转录激活蛋白经由连接适配子或通过蛋白质
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蛋白质相互作用将自身与所述催化灭活CRISPR酶连接。
32.根据权利要求29所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述转录灭活蛋白经由连接适配子或通过蛋白质
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蛋白质相互作用将自身与所述催化灭活CRISPR酶连接。33.根据权利要求30所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述转录阻遏蛋白经由连接适配子或通过蛋白质
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蛋白质相互作用将自身与所述催化灭活CRISPR酶连接。34.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第二核酸对与能够将自身与转录激活蛋白连接的适配子可操作地连接的引导RNA进行编码。35.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第二核酸对与能够将自身与转录灭活蛋白连接的适配子可操作地连接的引导RNA进行编码。36.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述第二核酸对与能够将自身与转录阻遏蛋白连接的适配子可操作地连接的引导RNA进行编码。37.根据权利要求25、28、31和34中任一权利要求所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述转录激活蛋白选自由以下组成的群组：VP16、VP64和VP160、VPR。38.根据权利要求26、29、32和35和16.1中任一权利要求所述的重组模块化CRISPRDNA构建体，其中所述转录灭活蛋白选自由以下组成的群组：Mxi1、Tbx3、KRAB、EnR和SID。39.根据权利要求27、30、33和36中任一权利要求所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述转录阻遏蛋白选自由以下组成的群组：Mxi1、Tbx3、KRAB、EnR和SID。40.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述模块化CRISPRDNA构建体是环状的。41.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述模块化CRISPRDNA构建体是线性的。42.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述模块化CRISPRDNA构建体被整合到生物体的基因组中。43.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述不同的cTAG中的至少一个包括至少两个经过验证的CRISPR着陆位点。44.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述CRISPR着陆位点中的至少一个是用于Cas9核酸内切酶。45.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述CRISPR着陆位点中的至少一个是用于Cpf1核酸内切酶。46.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述不同的cTAG中的至少一个包括罕见的(≥8个碱基长)限制性核酸内切酶位点。47.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中每个cTAG包括罕见的(≥8个碱基长)限制性核酸内切酶位点。48.根据权利要求1所述的模块化CRISPR DNA构建体，其中所述催化灭活CRISPR酶是突变的Cas9核酸内切酶。49.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述催化灭活CRISPR酶是突变的Cpf1核酸内切酶。50.根据权利要求1所述的模块化CRISPR DNA构建体，其中所述催化灭活CRISPR酶选自表1的载体中包含的dCas9基因中。51.根据权利要求1所述的模块化CRISPR DNA构建体，其中所述催化灭活CRISPR酶选自
由以下组成的群组：新凶手弗朗西丝菌(UniProtKB—A0Q7Q2(CPF1_FRATN))、毛螺菌科细菌(UniProtKB—A0A182DWE3(A0A182DWE3_9FIRM))和氨基酸球菌(UniProtKB—U2UMQ6(CPF1 ACISB)。52.根据权利要求1所述的模块化CRISPR DNA构建体，其中所述催化灭活CRISPR酶是AsCpf1(D908A)。53.根据权利要求1所述的重组模块化CRISPR DNA构建体，其中所述重组模块化CRISPR DNA构建体针对能够将(c)的所述催化灭活CRISPR酶募集到DNA靶位点的多于一个引导RNA进行编码。54.根据权利要求53所...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：齐默尔根公司，
类型：发明
国别省市：