一种水貂IFN-ε成熟肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种水貂IFN

【技术实现步骤摘要】
一种水貂IFN
‑
ε
成熟肽的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种干扰素的制备方法，特别涉及一种水貂IFN
‑
ε成熟肽的制备方法。本专利技术属于生物


技术介绍

[0002]干扰素(Interferon，IFN)是一类具有广泛生物学活性的蛋白质，具有调节机体免疫功能、抗病毒等作用，是机体防御系统的重要组成部分。自从Isaacs和Lindenmann发现干扰素以来已经有50多年的历史，人们对IFN的研究、开发及应用从未停止过。目前，IFN已被证实在人医临床上对多种病毒病的辅助治疗效果显著。2003Kotenko等根据IFN蛋白家族基于它们的基因序列、染色体定位和受体特异性分为三型，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干扰素，Ⅰ型包括IFN
‑
α、β、ω、ε、κ、δ、τ、ζ等，Ⅱ型干扰素由单基因家族IFN
‑
γ构成，又称为免疫干扰素。1999年首次报道了人的ε
‑
干扰素(IFN
‑
ε)，其主要在肺脏、脑、小肠和生殖系统组织中表达，之后老鼠、猪、犬的IFN
‑
ε基因逐步被报道。IFN
‑
ε被认为在生殖功能中起到重要作用，在哺乳动物胎盘保护病毒感染及早期胎盘发育有重要作用。截止目前，只有人、恒河猴、牛和犬的IFN
‑
ε的生物学功能有相关报道，还未见水貂(Mustela vison)IFN
‑
ε基因克隆和表达方面的相关研究报道。
[0003]近几年我国毛皮动物产业发展较迅速，是国际上少数毛皮动物养殖业发达的国家之一，由于水貂犬瘟热、细小病毒病和阿留申病毒病等危害养貂业传染病时常发生，造成严重经济损失。这些病毒性传染病发病急，死亡率高，普通药物治疗效果不理想，因此研制开发具有抗病毒活性的基因工程干扰素制剂，是一种理想的选择。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的之一在于提供一种优化后的水貂IFN
‑
ε成熟肽的编码核苷酸序列。
[0005]本专利技术的目的之二在于提供一种水貂IFN
‑
ε成熟肽的制备方法。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
[0007]本专利技术的一种优化后的水貂IFN
‑
ε成熟肽的编码核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]进一步的，本专利技术还提出了所述的核苷酸序列在制备水貂IFN
‑
ε成熟肽中的应用。
[0009]更进一步的，本专利技术还提出了一种水貂IFN
‑
ε成熟肽的制备方法，包括以下步骤：
[0010](1)合成优化后的水貂IFN
‑
ε成熟肽的编码核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示，与TA克隆载体连接构建得到含有优化后的水貂IFN
‑
ε成熟肽的编码核苷酸序列的载体；
[0011](2)设计用于扩增水貂IFN
‑
ε成熟肽基因的引物，引物序列如下：
[0012]上游：5
’–
CGGGGTACCGACGACGACGACAAG TTAGAACTGAAACTG
‑3’
；
[0013]下游：5
’‑
CCGCTCGAG TCAAACAATGGTCCAG；
[0014]以稀释后的含有优化后的水貂IFN
‑
ε成熟肽的编码核苷酸序列的载体溶液为模板，采用上述引物进行PCR扩增，PCR产物回收纯化后，与表达载体连接并转化E.coli.感受
态细胞中，经PCR及酶切鉴定后，得到含有优化后的水貂IFN
‑
ε成熟肽的编码核苷酸序列的表达载体；
[0015](3)将步骤(2)中得到的含有优化后的水貂IFN
‑
ε成熟肽的编码核苷酸序列的表达载体转化BL21(DE3)感受态细胞，当菌液OD
600
数值达到0.4～0.6时加入IPTG诱导表达，37℃恒温摇床培养；
[0016](4)培养结束后，取出菌液，离心，去除上清液体保留沉淀；用PBS对沉淀进行重悬后，离心去除上清液体保留沉淀，用1/10原菌液体积的PBS进行重悬，应用Ni
‑
NTA纯化蛋白，纯化后的蛋白即为水貂IFN
‑
ε成熟肽，置
‑
80℃冻存，。
[0017]其中，优选的，步骤(1)中所述的TA克隆载体为pMD18
‑
T载体。
[0018]其中，优选的，步骤(2)中所述的表达载体为pET
‑
32a表达载体。
[0019]其中，优选的，步骤(2)中水貂IFN
‑
ε成熟肽基因扩增反应体系为：10
×
EхTaq Buffer2.5μL，2.5mmol/μL dNTP4μL，25pmol/μL上、下游引物各1μL，25pmol Taq DNA聚合酶1μL，加入3μL稀释100倍后的pMD18
‑
T/MiIFN
‑
ε质粒溶液为模板，用灭菌去离子水补足25μL；反应条件为：将25μL反应液混匀后，于PCR仪上进行扩增，循环参数为95℃预变性5min，94℃45s，53℃45s，72℃50s，34个循环后72℃延伸10min。
[0020]按照所述的方法制备得到的水貂IFN
‑
ε成熟肽也在本专利技术的保护范围之内。
[0021]最后，本专利技术还提出了所述的水貂IFN
‑
ε成熟肽在制备抗病毒制剂中的用途。
[0022]相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：
[0023]本专利技术构建了含有优化后的编码水貂IFN
‑
ε成熟肽基因的重组表达载体，并在大肠杆菌中成功表达。对其抗病毒活性进行分析，结果显示，得到的重组水貂IFN
‑
ε成熟肽具有明显的抗病毒活性。
附图说明
[0024]图1为PCR扩增IFN
‑
ε结果；
[0025]其中：1.水貂IFN
‑
ε基因扩增；2.IFN
‑
ε成熟肽基因扩增；3.阴性对照；4.100bp DNAMarker；
[0026]图2为MinkIFN
‑
ε基因的核酸序列和氨基酸序列；
[0027]注：下划线为信号肽编码序列；
[0028]图3为编码水貂IFN
‑
ε成熟肽基因序列与大肠杆菌密码子优化后的基因序列比对；
[0029]图4为水貂IFN
‑
ε基因在大肠杆菌中的表达及纯化；
[0030]其中：1.蛋白分子量Marker；2.未诱导对照；3.重组mMiIFN
‑
ε在大肠杆菌中表达全菌；4.裂解后离心沉淀；5.裂解离心上清；6.表达产本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种优化后的水貂IFN
‑
ε成熟肽的编码核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的核苷酸序列在制备水貂IFN
‑
ε成熟肽中的应用。3.一种水貂IFN
‑
ε成熟肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)合成优化后的水貂IFN
‑
ε成熟肽的编码核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示，与TA克隆载体连接构建得到含有优化后的水貂IFN
‑
ε成熟肽的编码核苷酸序列的载体；(2)设计用于扩增水貂IFN
‑
ε成熟肽基因的引物，引物序列如下：上游：5
’–
CGGGGTACCGACGACGACGACAAGCTGGAACTGAAACTGG
‑3’
；下游：5
’‑
CCGCTCGAGTTATTTAGACAGTTTA；以稀释后的含有优化后的水貂IFN
‑
ε成熟肽的编码核苷酸序列的载体溶液为模板，采用上述引物进行PCR扩增，PCR产物回收纯化后，与表达载体连接并转化E.coli.感受态细胞中，经PCR及酶切鉴定后，得到含有优化后的水貂IFN
‑
ε成熟肽的编码核苷酸序列的表达载体；(3)将步骤(2)中得到的含有优化后的水貂IFN
‑
ε成熟肽的编码核苷酸序列的表达载体转化BL21(DE3)感受态细胞，当菌液OD
600
数值达到0.4～0.6时加入IPTG诱导表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海玲，卢士英，白雪，廉士珍，胡博，章沙沙，张蕾，张东亮，李双双，李虹晔，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：