重组人干扰素hIFN-κ基因工程菌株及其构建方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种重组人干扰素hIFN

【技术实现步骤摘要】
NO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列；c)在SEQ ID NO:2序列基础上插入、缺失/添加一个或多个核苷酸残基，且能够编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和d)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0008]其中，所述核酸构建体是可介导hIFN
‑
κ基因表达的载体。优选地，所述核酸构建体为质粒载体或病毒载体；更优选地，所述核酸构建体为质粒载体，且所述质粒选自但不限于pET30a、pCZN1、pET22b和pET28a中的任意一种。
[0009]根据本专利技术的第三个方面，提供了一种重组hIFN
‑
κ基因工程菌株，所述基因工程菌株包含如上所述的优化的编码hIFN
‑
κ的核苷酸序列或包含如上所述的核酸构建体。
[0010]具体地，所述基因工程菌株包含核酸构建体，所述的核酸构建体包含编码hIFN
‑
κ的核苷酸序列，所述核苷酸序列为选自以下的任一种：a)编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；b)与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性，且能够编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列；c)在SEQ ID NO:2序列基础上插入、缺失/添加一个或多个核苷酸残基，且能够编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和d)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0011]其中，所述基因工程菌株的出发细胞为真核细胞，优选为植物细胞、动物细胞、真菌细胞，更优选为酵母细胞。
[0012]其中，所述基因工程菌株的出发细胞为原核细胞，优选为细菌，更优选为枯草芽孢杆菌或大肠杆菌细胞；最优选为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
[0013]优选地，所述基因工程菌株是pET30a
‑
hIFN
‑
k
‑
BL21基因工程菌株。
[0014]根据本专利技术的第四个方面，提供一种基因工程菌株的构建方法，包括通过转染(真核细胞)、转导(病毒载体)或转化(原核细胞)的方式将含有能够编码表达hIFN
–
κ的核苷酸序列的核酸构建体导入宿主细胞而获得所述基因工程菌株。
[0015]其中，所述导入是通过转化的方式将能够在原核细胞中表达的载体转化到宿主细胞中。优选地，所述转化为电转化；更优选地，所述转化为热激转化。
[0016]根据本专利技术的第五个方面，提供一种生产hIFN
‑
κ蛋白的方法，所述方法通过培养所述基因工程菌株和诱导基因表达获得hIFN
‑
κ蛋白。
[0017]优选地，所述方法包括以下步骤：
[0018](1)表达载体构建：将密码子优化后的hIFN
‑
κ的核苷酸序列连接至载体，对合成的载体进行双酶切及测序验证；
[0019](2)导入宿主细胞：将合成的表达载体导入宿主细胞中，培养，选取单菌落；
[0020](3)诱导表达：接种步骤(2)的单菌落，培养，加入0.4
‑
1.2mM的IPTG(异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷)，诱导表达hIFN
‑
κ。
[0021]具体地，一种生产hIFN
‑
κ蛋白的方法，包括以下步骤：
[0022](1)表达载体构建：将密码子优化后的hIFN
‑
κ的核苷酸序列合成至pET
‑
30a载体，对合成的载体pET30a
‑
hIFN
‑
κ进行XhoⅠ和ApaⅠ双酶切及测序验证；
[0023](2)导入宿主细胞：将合成好的pET30a
‑
hIFN
‑
κ表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，培养，选取单菌落；
[0024](3)诱导表达：接种步骤(2)获得的单菌落，培养，加0.4
‑
1.2mM的IPTG，诱导表达
hIFN
‑
κ。
[0025]在一个具体的实施方式中，将密码子优化后的SEQ ID NO:2所示的hIFN
‑
κ的核苷酸序列合成至pET
‑
30a载体，插入位点为NdeⅠ(CATATG)
‑
XhoⅠ(CTCGAG)，对合成的载体pET30a
‑
hIFN
‑
κ进行Xho
Ⅰ‑
ApaⅠ双酶切及测序验证。
[0026]在一个具体的实施方式中，将pET30a
‑
hIFN
‑
κ表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，在不含卡那霉素的LB固体培养基上36
‑
38℃培养0.5
‑
2h，然后将其涂布在含卡那霉素的LB固体培养基上36
‑
38℃培养过夜，挑取单菌落。
[0027]在一个具体的实施方式中，将步骤(2)获得的单菌落接种在LB液体培养基中，36
‑
38℃培养过夜，将培养液以0.5
‑2‰
(体积百分比)的接种量转接至摇瓶中(LB液体培养基，含卡那霉素1
‰
)，36
‑
38℃培养至OD600为0.4
‑
1.2时，加入终浓度为0.4
‑
1.2mM的IPTG，36
‑
38℃诱导表达2
‑
4h。
[0028]优选地，当培养至OD600值为0.4
‑
1.2、0.5
‑
1、0.6
‑
0.9或0.7
‑
0.8时，加入终浓度为0.4
‑
1.2mM的IPTG诱导表达。
[0029]优选地，加入0.4
‑
1.2mM、0.5
‑
1.1mM、0.6
‑
1.0mM、0.7
‑
0.9mM的IPTG诱导表达，更优选地，加入0.8mM的IPTG诱导表达。
[0030]根据本专利技术的另一方面，提供了上述的基因工程菌株在制备hIFN
‑
κ中的用途。
[0031]根据本专利技术的又一方面，提供了上述的方法生产的hIFN
‑
κ在制备抗病毒药物中的应用。
[0032]本专利技术的有益效果如下：
[0033]pBV220是目前国内较为通用的高效表达载体，天然hIFN
‑
κ基因与pBV220连接后表达非常低，为有效地实现hIFN
‑
κ的高表达，专利技术人设计了全新的hIFN
‑
κ基因，在保留编码蛋白的DNA序列的同时以大肠杆菌喜用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种优化的编码hIFN
‑
κ的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为选自以下的任一种：a)编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；b)与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性，且能够编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列；c)在SEQ ID NO:2序列基础上插入、缺失/添加一个或多个核苷酸残基，且能够编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和d)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。2.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包含如权利要求1所述的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体是可介导hIFN
‑
κ基因表达的载体，优选地，所述核酸构建体是病毒载体或质粒载体。4.根据权利要求3所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体为质粒载体，且所述质粒选自但不限于pET30a、pCZN1、pET22b和pET28a中的任意一种。5.一种重组hIFN
‑
κ基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株包含如权利要求1所述的核苷酸序列或包含如权利要求2
‑
4中任一项所述的核酸构建体。6.根据权利要求5所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的出发细胞为真核细胞，优选为植物细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭继先，刘翠英，李俊霞，赵杏蕊，任文杰，董庆茹，杨粉，刘敬，
申请(专利权)人：山东晶辉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：