具备表面展示苯丙氨酸解氨酶的工程益生菌制造技术

本发明专利技术公开了一种具备表面展示苯丙氨酸解氨酶的工程益生菌，其为大肠杆菌Nissle 1917衍生菌，在基因组上敲除了基因argR和/或发生了基因argA(Y19C)突变，整合了L

【技术实现步骤摘要】
具备表面展示苯丙氨酸解氨酶的工程益生菌


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体地说，涉及一种具备表面展示苯丙氨酸解氨酶的工程益生菌、其构建方法及其在制备苯丙酮尿症治疗药物中的应用。

技术介绍

[0002]苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是一种先天性的苯丙氨酸代谢障碍疾病，是一种常染色体隐性遗传病。在中国，PKU在新生儿中的发病率大概在1/11000，已被列为新生儿必查的疾病项目。
[0003]苯丙酮尿症是因肝脏苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)缺乏或四氢生物喋呤合成酶、二氢生物喋呤还原酶突变导致。正常情况下，苯丙氨酸经PAH催化生成酪氨酸，然后通过酪氨酸代谢途径合成甲状腺、肾上腺和黑色素等。PAH突变，导致苯丙氨酸在肝脏中出现代谢紊乱，无法转化为酪氨酸，而是苯丙氨酸与α
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酮戊二酸在血液与组织中堆积并被排泄到尿液中，另外，其代谢产物在中枢神经中蓄积会产生毒性，从而诱发患儿出现兴奋不安、多动和精神异常等。
[0004]目前对PKU的治疗方法主要是食疗法。苯丙氨酸作为人体必需氨基酸之一，主要从食物中获取，对于PKU患儿不能无苯丙氨酸饮食，所以为了保证机体的正常生长发育，需要对PKU患儿采取低苯丙氨酸饮食，但食疗存在长期坚持困难和经济负担重等问题。随着分子生物学技术的发展，基因治疗已进入了实验阶段，例如，将携带表达PAH基因的cDNA重组腺病毒置于小鼠体内，以恢复肝脏PAH活性，但目前主要存在转运效率低的问题。
专利
技术实现思路

[0005]益生菌是一大类药物，一般通过口服活菌制剂达到治疗疾病和康复保健效果。益生菌药物制剂的优点在于给药方便，口感较好，病人乐于接受，顺从性高，而且能够持续地在肠道内增殖从而稳定地发挥治疗作用。
[0006]大肠杆菌属E.coli Nissle 1917(简写为EcN或者Nissle 1917)是一种非致病性大肠杆菌，也是一种益生菌。申请人在专利技术专利CN202011457369.7中报道了一种可用于治疗苯丙酮尿症的Nissle 1917工程益生菌对苯丙氨酸的降解能力，增强其治疗苯丙酮尿症的效果。专利技术人继续利用基因工程技术来改造Nissle 1917工程益生菌，使其具备表面展示苯丙氨酸解氨酶，进一步提高其降解苯丙氨酸的能力。具体而言，本专利技术包括如下技术方案：
[0007]一种工程益生菌，其为大肠杆菌Nissle 1917衍生菌，其具备表面展示的苯丙氨酸解氨酶(L
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phenylalanine ammonia
‑
lyase，PAL)。
[0008]上述的工程益生菌是以大肠杆菌Nissle 1917为底盘菌，通过质粒表达或者基因组整合构建出表面展示L
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苯丙氨酸解氨酶PAL的大肠杆菌Nissle 1917工程益生菌；或者是以胞内已具备苯丙氨酸解氨酶PAL的大肠杆菌Nissle 1917工程菌为基础，再进行表面展示苯丙氨酸解氨酶PAL的基因工程改造而得到的Nissle 1917工程益生菌。
[0009]例如，以大肠杆菌Nissle 1917为底盘菌，通过质粒表达或者基因组整合构建出表面展示L
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苯丙氨酸解氨酶基因stlA的大肠杆菌Nissle 1917工程益生菌。所述质粒例如可以是pINP
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stlA质粒，转化入Nissle 1917(EcN)后，得到重组工程益生菌EcN/pINP
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stlA。
[0010]上述的胞内已具备苯丙氨酸解氨酶PAL的大肠杆菌Nissle 1917工程菌可以通过下述步骤构建得到：在大肠杆菌Nissle 1917基因组上整合了外源L
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苯丙氨酸解氨酶基因stlA、外源L
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苯丙氨酸内运蛋白基因pheP和外源L
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氨基酸脱氨酶基因pma。
[0011]优选地，还整合了内源(即，来源于Nissle 1917)的外排泵基因acrA；并且/或者
[0012]敲除了基因argR和/或发生了基因argA(Y19C)突变；并且/或者
[0013]对stlA、pheP、acrA基因的RBS序列进行优化。
[0014]优选地，所述L
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苯丙氨酸解氨酶(Genbank号KGM29850.1)基因stlA的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；
[0015]所述L
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苯丙氨酸内运蛋白(Genbank号QPA14453.1)基因pheP的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
[0016]所述L
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氨基酸脱氨酶(Genbank号AAA86752.1)基因pma的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
[0017]所述外排泵蛋白(Genbank号WP_001295833.1)基因acrA的核苷酸序列可以是SEQ ID NO:4。
[0018]进一步地，上述的RBS序列优化可以是，基因组中stlA基因的RBS(ribosome binding site，核糖体结合位点)序列由GCTAGCAGGATACTTCCAATCCATGGCAACAAAACAAAAAGTAGAGGAGGTAAAT优化为CTCGCGAGAATTAAGAAGAAAGGAGGTTTTTTTT(SEQ ID NO:5)；pheP基因的RBS序列由GCTAGCAGGATACTTCCAATCCATGGCAACAAAACAAAAAGTAGAGGAGGTAAAT优化为GGAGTTATCTCTCCCGGGTCACAATATTAAGGAGGTTTTATTT(SEQ ID NO:6)；acrA基因的RBS序列由GCTAGCAGGATACTTCCAATCCATGGCAACAAAACAAAAAGTAGAGGAGGTAAAT优化为GAGGCTAACAGGCACATTCAATAAGGAGGTTTTTT(SEQ ID NO:7)。
[0019]上述大肠杆菌Nissle 1917衍生菌的基因组中还可以敲除二氢吡啶二羧酸合酶基因dapA。
[0020]优选地，上述工程益生菌的基因型是：EcN(malP::Pj23119H
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stlA,yicS::Pj23119H
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stlA,malE::Pj23119H
‑
stlA,rthC::Ptac
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stlA,exo::Ptac
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stlA,lacZ::Pj23119H
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pheP,agaI::Pj23119H
‑
pheP,araBD::Para
‑
pma,dapA::inaK
‑
stlA,argA*,
△
argR,lacZ::Pj23119H
‑
acrA)。
[0021]本专利技术的第二个方面提供了一种构建上述工程益生菌的方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种工程益生菌，其为大肠杆菌Nissle 1917衍生菌，其特征在于，具备表面展示的L
‑
苯丙氨酸解氨酶。2.如权利要求1所述的工程益生菌，其特征在于，以大肠杆菌Nissle 1917为底盘菌，通过质粒表达或者基因组整合而得到；或者以胞内已具备苯丙氨酸解氨酶的大肠杆菌Nissle 1917工程菌为基础，再进行表面展示苯丙氨酸解氨酶的基因工程改造而得到。3.如权利要求2所述的工程益生菌，其特征在于，所述胞内已具备苯丙氨酸解氨酶的大肠杆菌Nissle 1917工程菌通过下述步骤构建得到：在大肠杆菌Nissle 1917基因组上整合了外源L
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苯丙氨酸解氨酶基因stlA、外源L
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苯丙氨酸内运蛋白基因pheP和外源L
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氨基酸脱氨酶基因pma。4.如权利要求3所述的工程益生菌，其特征在于，还整合了内源的外排泵基因acrA；并且/或者敲除了基因argR和/或发生了基因argA(Y19C)突变；并且/或者对stlA、pheP、acrA基因的RBS序列进行优化。5.如权利要求4所述的工程益生菌，其特征在于，所述L
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苯丙氨酸解氨酶基因stlA的核苷酸序列是SEQ ID NO:1；所述L
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苯丙氨酸内运蛋白基因pheP的核苷酸序列是SEQ ID NO:2；所述L
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氨基酸脱氨酶基因是pma的核苷酸序列是SEQ ID NO:3；所述外排泵基因acrA的核苷酸序列是SEQ ID NO:4。6.如权利要求4所述的工程益生菌，其特征在于，stlA基因的RBS序列变化为SEQ ID NO:5；pheP基因的RBS序列变化为SEQ ID NO:6；acrA基因的RBS序列变化为SEQ ID NO:7。7.如权利要求1所述的工程益生菌，其特征在于，菌株的基因型是：EcN(malP::Pj23119H
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stlA,yicS::Pj23119H
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stlA,malE::Pj23119H
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stlA,exo::Ptac
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pma,dapA::inaK
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argR,lacZ::Pj23119H
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acrA)。8.一种构建如权利要求1
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7中...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋宇，
申请(专利权)人：上海陶宇晟生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：