用于治疗苯丙酮尿症的工程益生菌制造技术

本发明专利技术公开了一种用于治疗苯丙酮尿症的工程益生菌及其制备方法，其为大肠杆菌Nissle 1917衍生菌，在基因组上整合了外源L

【技术实现步骤摘要】
用于治疗苯丙酮尿症的工程益生菌


[0001]本专利技术属于基因工程领域和医药领域，具体地说，涉及一种用于治疗苯丙酮尿症的工程益生菌、其制备方法及其在制备苯丙酮尿症治疗药物中的应用。

技术介绍

[0002]苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是一种先天性的苯丙氨酸代谢障碍疾病。在中国，PKU在新生儿中的发病率大概在1/11000，PKU患儿出生若不及时诊治，将会出现高苯丙酸血症，严重影响患儿的智力发育，引起癫痫和运动障碍等症状，并伴随黑色素合成障碍。
[0003]苯丙酮尿症是因肝脏苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)缺乏或四氢生物喋呤合成酶、二氢生物喋呤还原酶突变导致。PAH主要是在肝脏中表达，可将苯丙氨酸转化为酪氨酸，从而合成甲状腺、肾上腺和黑色素等。PAH突变，导致苯丙氨酸在肝脏中出现代谢紊乱，无法转化为酪氨酸，而是苯丙氨酸与α
‑
酮戊二酸在血液与组织中堆积并被排泄到尿液中，另外，其代谢产物在中枢神经中蓄积会产生毒性，从而诱发患儿出现兴奋不安、多动和精神异常等。
[0004]苯丙氨酸作为人体必需氨基酸之一，主要从食物中获取，对于PKU患儿不能完全不摄入苯丙氨酸，所以目前对PKU患儿的唯一治疗方法就是采取低苯丙氨酸饮食的食物限制策略，但是这种策略对于青少年的发育和孕妇具有极大的副作用，而且由于该类食品口感差，病人依从性差。另外，目前也有一些针对PKU治疗的策略尚在实验阶段，例如，通过体外重组表达具有苯丙氨酸降解能力的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia
‑
lase，stlA)，通过口服蛋白降低血液中苯丙氨酸，但缺点是直接口服蛋白易被肠道内的消化酶分解。科学家也在尝试基因疗法，将携带表达PAH基因的cDNA重组腺病毒置于小鼠体内，以恢复肝脏PAH活性，但目前主要存在转运效率低和疗效不长久的问题。
[0005]目前，国际上使用较多的苯丙酮尿症动物模型主要是上世纪90年代初由国外实验室通过化学诱变得到的Pah
enu1
和Pah
enu2
两种疾病模型，这两种疾病模型虽然能够模拟苯丙酮尿症的疾病表型，但是这两种动物模型的突变型并不能代表绝大多数的病人，因此并不具有临床代表性。从苯丙酮尿症突变型数据库中，可以发现目前临床上最具代表性的突变型为PAH
R408W
，该突变型患病人数占21.4％，是目前患者携带人数最多的突变型。因此，使用Pah
R408W
突变的PKU小鼠模型能够更好地模拟临床病人的疾病表征，并且该Pah
R408W
的小鼠模型在PKU治疗的研究领域中也有相关报道。

技术实现思路

[0006]益生菌是一大类药物，主要通过口服活菌制剂达到治疗疾病和康复保健效果。益生菌药物制剂的优点在于给药方便，口感一般较好，病人乐于接受，顺从性高，更重要的是能够持续地在肠道内增殖从而稳定地发挥治疗作用。
[0007]大肠杆菌属Nissle 1917(简称EcN)是一种非致病性大肠杆菌，是1917年从一次志
贺菌痢大爆发时未出现腹泻的士兵的粪便中分离得到的。EcN是非乳酸益生菌中研究最多的益生菌，血清型为O6：K5：H1，具有独特的基因组、半粗糙O6
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脂多糖(LPS)表型、K5型荚膜、3种不同的菌毛(F1A、F1C和卷曲菌毛)。EcN具有小菌素和铁摄取系统等特殊适应性因子，在与其他微生物竞争中起关键作用。EcN能长期稳定定植于肠道，与肠上皮细胞相互作用，被广泛用于预防传染性腹泻、炎性肠疾病如溃疡性结肠炎和克罗恩病，防止新生儿消化道内病原菌定殖等，和发挥免疫调节生物学功能。
[0008]为了寻求新的苯丙酮尿症治疗药物，专利技术人利用基因工程技术来改造大肠杆菌Nissle1917(EcN)，使其能够降解苯丙氨酸，构建出了一株经动物实验证明具有降解苯丙氨酸效应、因此有潜力用于治疗苯丙酮尿症的工程益生菌。具体而言，本专利技术包括如下技术方案：
[0009]一种用于治疗苯丙酮尿症的工程益生菌，其为大肠杆菌Nissle 1917衍生菌，在基因组上整合了外源L
‑
苯丙氨酸解氨酶基因比如stlA、L
‑
苯丙氨酸内运蛋白基因pheP和L
‑
氨基酸脱氨酶基因比如pma。
[0010]优选地，所述L
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苯丙氨酸解氨酶(Genbank号KGM29850.1)基因是stlA，核苷酸序列为SEQ ID NO:1；
[0011]所述L
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苯丙氨酸内运蛋白(Genbank号QPA14453.1)基因是pheP，核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
[0012]所述L
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氨基酸脱氨酶(Genbank号AAA86752.1)基因是pma，核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
[0013]进一步地，上述大肠杆菌Nissle 1917衍生菌的基因组中还可以敲除二氢吡啶二羧酸合酶基因dapA。
[0014]在一种实施方式中，上述工程益生菌的基因型为Nissle 1917(yicS::pfnrs
‑
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pma,
△
dapA)，或者表示为EcN(yicS::pfnrs
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‑
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‑
pma,
△
dapA)，本文中命名为CIBT4564。
[0015]本专利技术的第二个方面提供了一种构建上述工程益生菌的方法，包括以下步骤：
[0016]A.以大肠杆菌Nissle 1917为底盘菌，分别在基因组的yicS位点、malPT位点、malE位点、exo位点和rhtCB位点中的一个以上位点、优选两个以上位点、优选三个以上位点、优选四个以上位点、优选五个位点敲入L
‑
苯丙氨酸解氨酶基因比如stlA优选SEQ ID NO:1，获得stlA因整合菌株；
[0017]B.对于步骤A中获得的stlA因整合菌株，在其基因组的lacZ位点和agaI位点中的一个以上位点、优选两个位点敲入L<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于治疗苯丙酮尿症的工程益生菌，其为大肠杆菌Nissle 1917衍生菌，在基因组上整合了外源L
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苯丙氨酸解氨酶基因、L
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苯丙氨酸内运蛋白基因和L
‑
氨基酸脱氨酶基因。2.如权利要求1所述的工程益生菌，其特征在于，所述L
‑
苯丙氨酸解氨酶基因是stlA(SEQ ID NO:1)；所述L
‑
苯丙氨酸内运蛋白基因是pheP(SEQ ID NO:2)；所述L
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氨基酸脱氨酶基因是pma(SEQ ID NO:3)。3.如权利要求1所述的工程益生菌，其特征在于，所述大肠杆菌Nissle 1917衍生菌的基因组中敲除二氢吡啶二羧酸合酶基因dapA。4.如权利要求3所述的工程益生菌，其特征在于，其基因型为Nissle 1917(yicS::pfnrs
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dapA)。5.一种构建如权利要求1
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4中任一项所述工程益生菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.以大肠杆菌Nissle 19...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晟，孙兵兵，李大力，尹树明，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：