一种合成3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法技术

本发明专利技术提供一种合成3

【技术实现步骤摘要】
一种合成3
‑
岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种合成3
‑
岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法。

技术介绍

[0002]母乳是一种复杂的混合物，含有水、脂肪、蛋白质、矿物质、维生素、多糖、单糖、双糖(乳糖)、低聚糖。乳糖是母乳主要固体成分(总固形物的～6.8％)，同时广泛存在于动物乳汁。但是，结构较复杂的母乳低聚糖(总固形物的～1％)却是人类所独有的。目前，结构确证的母乳低聚糖大约有200种，聚合度从3到32不等。母乳低聚糖的结构特征包括乳糖
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N
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乙酰葡萄糖胺骨架、直链β
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(1,3/4)
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糖苷键、支链β
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(1,6)
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糖苷键、乳糖在糖链还原末端而L
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岩藻糖或唾液酸在非还原末端。
[0003]3‑
岩藻糖基乳糖是哺乳期母亲乳汁中普遍存在并且含量较为丰富的母乳低聚糖。3
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岩藻糖基乳糖占母乳低聚糖总量的比例可以高达5％。因此，3
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岩藻糖基乳糖的研究较为充分，并且发现3
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岩藻糖基乳糖具有多种有益功能。例如，3
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岩藻糖基乳糖特异性地抑制致病性大肠杆菌、诺如病毒与对应宿主受体的结合从而避免感染。3
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岩藻糖基乳糖可以抑制绿脓杆菌与局部上皮细胞的相互作用，从而避免绿脓杆菌对胃肠道、尿道和呼吸系统的感染。3
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岩藻糖基乳糖还可以特异性地增殖肠道特定有益菌从而调节肠道菌群的结构与功能。此外，3
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岩藻糖基乳糖通过上调肠道杯状细胞分泌相关基因的表达从而增强肠道黏液屏障功能。
[0004]3‑
岩藻糖基乳糖有益健康，并且，相关试验数据显示，符合食品安全法规要求，有望用作婴儿配方食品和医学营养产品的功能食品原料。然而，3
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岩藻糖基乳糖的工业化生产并非易事。早期，3
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岩藻糖基乳糖是从捐赠的母乳中色谱分离获得的，由于材料来源有限，无法大规模生产。3
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岩藻糖基乳糖可以直接化学合成，然而，受限于保护基团的化学性质，无法扩大规模，并且化学合成需要使用有毒试剂，更不适于大规模食品生产。岩藻糖基转移酶可以体外催化合成3
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岩藻糖基乳糖，但是，供体底物鸟苷二磷酸岩藻糖十分昂贵。因此，对于年产数百吨的工业生产，3
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岩藻糖基乳糖的酶法合成并不适用。微生物发酵是目前唯一适合大规模生产的技术路线。代谢工程、发酵工程、纯化工艺等技术进展，使3
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岩藻糖基乳糖的大规模生产逐步成为现实。在发酵过程中，供体底物分子鸟苷二磷酸岩藻糖由微生物自身从头合成，而受体底物分子乳糖一般由外部加入。
[0005]因此，构建一种合成3
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岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，有效促进3
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岩藻糖基乳糖的发酵合成，并为未来规模化生产奠定坚实基础是本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术所解决的技术问题在于提供一种合成3
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岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法，克服了同源重组技术的试验周期较长、成功率较低等难题，优化外源岩藻糖基转移酶基因的表达，有效地促进了3
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岩藻糖基乳糖的合成，从而实现3
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岩藻糖基
乳糖的高效发酵合成。
[0007]为了解决上述技术问题，一方面，本专利技术的方案提供一种合成3
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岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是在大肠杆菌原始菌株的基因组中敲除β
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半乳糖苷酶基因、从鸟苷二磷酸岩藻糖出发合成可拉酸的关键酶基因，强化表达乳糖通透酶基因、鸟苷二磷酸岩藻糖从头合成途径的关键酶基因，并表达外源岩藻糖基转移酶基因得到的。
[0008]优选地，所述敲除β
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半乳糖苷酶基因是指利用CRISPR基因编辑技术敲除β
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半乳糖苷酶基因lacZ，敲除从鸟苷二磷酸岩藻糖出发合成可拉酸的关键酶基因是指利用CRISPR基因编辑技术敲除十一碳二烯磷酸酯葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ。
[0009]优选地，利用CRISPR基因编辑技术敲除十一碳二烯磷酸酯葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ时，敲除基因wcaJ的gRNA1的靶标序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，敲除基因wcaJ的gRNA2的靶标序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，PCR鉴定的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PCR鉴定的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0010]优选地，利用CRISPR基因编辑技术敲除β
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半乳糖苷酶基因lacZ时，敲除基因lacZ的gRNA1的靶标序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，敲除基因lacZ的gRNA2的靶标序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，PCR鉴定的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，PCR鉴定的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0011]优选地，所述强化表达乳糖通透酶基因、鸟苷二磷酸岩藻糖从头合成途径的关键酶基因是指利用CRISPR基因编辑技术在鸟苷二磷酸岩藻糖从头合成途径的磷酸甘露糖变位酶基因manB上游敲入T7lac启动子。
[0012]优选地，利用CRISPR基因编辑技术在鸟苷二磷酸岩藻糖从头合成途径的磷酸甘露糖变位酶基因manB上游敲入T7lac启动子时，敲入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，敲入位置上游基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，敲入位置下游基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，PCR鉴定的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，PCR鉴定的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
[0013]优选地，所述重组大肠杆菌携带用于诱导高表达蛋白质的多个重组质粒，所述重组质粒分别包含基因manB、甘露糖
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磷酸鸟苷转移酶基因manC、鸟苷二磷酸甘露糖
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4,6
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脱水酶基因gmd、鸟苷二磷酸
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L
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岩藻糖合成酶基因fcl、乳糖通透酶基因lacY、外源岩藻糖基转移酶基因。
[0014]优选地，所述外源岩藻糖基转移酶cafF基因源自嗜黏蛋白阿克曼氏菌，密码子优化的cafF基因序列如SEQ ID NO.14所示。
[0015]优选地，原始菌株为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0016]具体实现过程中，本专利技术提供一种合成3
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岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，采用CRISPR基因编辑技术，敲除原始菌株基因组十一碳二烯磷酸酯本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成3
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岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌是在大肠杆菌原始菌株的基因组中敲除β
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半乳糖苷酶基因、从鸟苷二磷酸岩藻糖出发合成可拉酸的关键酶基因，强化表达乳糖通透酶基因、鸟苷二磷酸岩藻糖从头合成途径的关键酶基因，并表达外源岩藻糖基转移酶基因得到的。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述敲除β
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半乳糖苷酶基因是指利用CRISPR基因编辑技术敲除β
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半乳糖苷酶基因lacZ，敲除从鸟苷二磷酸岩藻糖出发合成可拉酸的关键酶基因是指利用CRISPR基因编辑技术敲除十一碳二烯磷酸酯葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ。3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于：利用CRISPR基因编辑技术敲除十一碳二烯磷酸酯葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ时，敲除基因wcaJ的gRNA1的靶标序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，敲除基因wcaJ的gRNA2的靶标序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，PCR鉴定的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PCR鉴定的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。4.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于：利用CRISPR基因编辑技术敲除β
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半乳糖苷酶基因lacZ时，敲除基因lacZ的gRNA1的靶标序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，敲除基因lacZ的gRNA2的靶标序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，PCR鉴定的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，PCR鉴定的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述强化表达乳糖通透酶基因、鸟苷二磷酸岩藻糖从头合成途径的关键酶基因是指利用CRISPR基因编辑技术在鸟苷二磷酸岩藻糖从头合成途径的磷酸甘露糖变位酶基因manB上游敲入T7lac启动子。6.根据权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于：利用CRISPR基因编辑技术在鸟苷二磷酸岩藻糖从头合成途径的磷酸甘露糖变位酶基因manB上游敲入T7lac启动子时，敲入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，敲入位置上游基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，敲入位置下游基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，PCR鉴定的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，PCR鉴定的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。7.根据权利要求1所述的重组大...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝占西，曾宪维，杨新球，魏远安，许本宏，阮鸿波，吴嘉仪，吴少辉，霍金洪，
申请(专利权)人：量子高科广东生物有限公司，
类型：发明
国别省市：