具有增强的L-谷氨酸生产力的菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了具有增强的L

【技术实现步骤摘要】
具有增强的L
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谷氨酸生产力的菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程和微生物
，具体涉及具有增强的L
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谷氨酸生产力的菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]L
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谷氨酸，化学名称为L
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氨基戊二酸,分子式为C5H9O4N，分子量为147.13。L
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谷氨酸是非必需氨基酸。在生物有机体中存在的谷氨酸，都属于L
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型谷氨酸。且L
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谷氨酸是味精的前体物质。味精被食用后，还可在胃中转化为谷氨酸，然后经消化吸收参与蛋白质的合成，并可通过转氨基作用合成其它氨基酸，营养价值较高。除了在食品方面的广泛应用外，还被应用于医药、化妆品及农业生产中。在人体的各大器官中，谷氨酸盐在大脑中的含量最高，同时谷氨酸是参与人脑代谢的唯一一种氨基酸，在神经系统功能的维护有重要作用。所以对神经衰弱者来说，加大谷氨酸摄入量可改善其神经系统的功能。在化妆品行业,谷氨酸可用于合成聚谷氨酸钠。由于该物质具有很强的吸湿性,可被用作润肤剂。谷氨酸也可以与月桂酞氯结合生成一月桂酞基谷氨酸钠，广泛应用于化妆品行业。谷氨酸在农业上主要用于生产杀菌剂，如谷氨酸酮。在施肥的过程中,谷氨酸还可以作为肥料的载体，促进农作物对氮磷钾的吸收。
[0003]1956年,从自然界中分离到了一种谷氨酸产生菌,即谷氨酸棒杆菌,这是味精生产史上的重大变革。1957年开始了通过发酵法生产味精的时代。发酵法生产谷氨酸的成功,是整个发酵工业的伟大创举,同时也大大促进了其它发酵产品的研究与生产。对于工业发酵来说，决定发酵生产水平的因素主要有菌种性能、发酵工艺及下游提取工艺等。在这些因素中,菌种的产酸水平是内因,是决定发酵成败的关键。优良菌种的选育依然是高产L
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谷氨酸的关键，随着高通量筛选技术的发展，结合传统诱变技术，有助于找到未知性状的高产L
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谷氨酸突变株。这些突变株有可能改变L
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谷氨酸代谢途径上某一点的活性或者整个途径的重组整合，从而来提高产酸量。
[0004]虽然已筛选到一些可以提高L
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谷氨酸产量的菌株，但是为了满足日益增加的需求，仍需要找到更多高产L
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谷氨酸的突变株。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种多核苷酸及含有该多核苷酸的重组菌株,以及将重组菌株用于改善细菌的L
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谷氨酸生产能力。为了实现上述目的，本专利技术的专利技术人研究发现，具有L
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谷氨酸生产能力的谷氨酸棒杆菌ATCC13869基因组(GenBank：CP016335.1)中BBD29_00405基因(GenBank：ANU32350.1)，可以通过修饰该基因或改善其表达，获得L
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谷氨酸产量提高的重组菌株，与未改造的野生型菌株相比，重组菌株的产L
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谷氨酸能力更强。
[0006]本专利技术采用如下技术方案实现：
[0007]本专利技术的第一方面，提供了生成L
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谷氨酸的细菌，其具有编码如SEQ ID NO:3所示
的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达。根据本专利技术，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。
[0008]所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列是基因BBD29_00405编码的蛋白。
[0009]所述细菌与未修饰菌株相比具有增强的L
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谷氨酸生产能力。
[0010]在本专利技术中，术语“具有L
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谷氨酸生产能力的细菌”是指具有在培养基和/或细菌的细胞中以下述程度产生并累积目的L
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谷氨酸的能力，使得当细菌在培养基中培养时可以收集L
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谷氨酸的细菌。具有L
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谷氨酸生产能力的细菌可以是能够以比未修饰菌株可获得的量更大的量在培养基和/或细菌的细胞中积累目的L
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谷氨酸的细菌。
[0011]术语“未修饰菌株”是指尚未以使得具有特定特征的方式进行修饰的对照菌株。即，未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。
[0012]在本专利技术中，除非另有说明，术语“L
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谷氨酸”是指游离形式的L
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谷氨酸、其盐或其混合物。
[0013]所述多核苷酸可以编码与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性的氨基酸序列。如本文中使用的，术语“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽模块之间的百分比同一性。可以通过使用本领域中已知的方法测定一种模块和另一种模块之间的序列同源性。例如，可以通过BLAST算法测定此类序列同源性。
[0014]可以如下增强多核苷酸的表达：通过取代或突变表达调节序列、对多核苷酸序列引入突变、通过经由染色体插入或载体导入的多核苷酸拷贝数的增加、或其组合等。
[0015]可以修饰多核苷酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核苷酸的表达，并且例如可以包括启动子、终止子、增强子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密码子的变化。可以将多核苷酸掺入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本文，特定的位点可以包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可以将多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，通过将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，通过将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而过表达所述核酸序列。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而过表达所述氨基酸序列。
[0020]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述多核苷酸可以包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的具有点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第199位甲硫氨酸被不同的氨基酸所取代。
[0022]根据本专利技术，优选第199位甲硫氨酸变为异亮氨酸所取代。
[0023]根据本专利技术，SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其中第199位甲硫氨酸变为异亮氨酸所取代本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生成L
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谷氨酸的细菌，其特征在于，具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达；优选，所述改善的表达是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。2.如权利要求1所述的细菌，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第199位甲硫氨酸被不同的氨基酸所取代；优选第199位甲硫氨酸被异亮氨酸所取代。3.如权利要求1或2所述的细菌，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。4.如权利要求1
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3任一项所述的细菌，其特征在于，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第597位碱基发生突变而形成的；优选，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第597位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)；优选，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。5.如权利要求1
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4任一项所述的细菌，其特征在于，所述细菌是棒杆菌属细菌，优选嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibact...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏厚波，魏爱英，孟刚，杨立鹏，马风勇，贾慧萍，周晓群，赵春光，
申请(专利权)人：宁夏伊品生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：