一种快速提取微量虫草菌DNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速提取微量虫草菌DNA的方法，按照以下步骤进行：首先取微量虫草菌孢子或组织置于2ml离心管内；再向离心管中加入50μL真菌DNA Pcr

【技术实现步骤摘要】
一种快速提取微量虫草菌DNA的方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及快速提取微量虫草菌及虫草药材DNA的技术方法。

技术介绍

[0002]虫草是一种珍稀中药材，天然虫草药材由于价格昂贵，导致市场上伪品甚多，“假草”和“毒草”横行。冬虫夏草有老君山线虫草Ophiocordyceps laojunshanensis Chen, Cao & Yang，甘肃虫草Cordyceps gansuensis Zhang, Wang & Yan，多轴虫草Cordycepsmultiaxialis Zang & Kinjo和尼泊尔虫草 Ophiocordyceps nepalensis (M. Zang & Kinjo) G.H. Sung et al.等众多的相似种类，以常规手段无法分辨。另外，还有大量无性型发酵的未完全成熟的子实体、菌丝体或其终端产品，如加工后的中药饮片、粉末和含有生药原型的传统中成药(丸剂、散剂等)的鉴定更加困难，传统上采用显微结构、超微结构等形态学鉴定已经无能为力。分子生物学的引入，使得可以从基因层面解决虫草中药材分类鉴定困难的问题，多数虫草中药材来源于野生资源，DNA提取困难，给分子系统学的研究带来障碍，故研究快速提取微量虫草菌DNA的技术方法迫在眉睫。

技术实现思路

[0003]本专利技术要解决的技术问题是针对上述问题提供一种快速提取微量虫草菌DNA的方法。
[0004]本专利技术具体是通过以下技术方案来实现的：一种快速提取微量虫草菌DNA的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、取微量虫草菌孢子或组织置于2ml离心管内；二、向步骤一中离心管中加入50μL 真菌DNA Pcr
‑
directly缓冲液，在水浴温度为75℃的条件下处理20min，再进行离心，得到的上清液为含虫草DNA的溶液。
[0005]上述快速提取微量虫草菌DNA的方法，离心的转速为14000r/min。
[0006]专利技术人指出：使用三种商用真菌DNA提取试剂盒（包括 Biomega、Omega、生工）对相同量的供试品（分为6个离心管）进行DNA提取实验。Biomega及Omega的提取时间为2.5个小时左右，所用试剂有5种。使用PCR directly，仅用1种试剂，耗时小于30min。采集的虫草菌标本在未能培养出菌丝时，有些标本较小，而商用真菌DNA提取试剂盒对样本需求量大，使用PCR directly，所需标本量仅需几微克。使用PCR directly试剂提取虫草菌DNA解决了标本量少，无法用商用真菌DNA提取试剂盒提取DNA的技术问题，且耗费时间少，成本较为低廉。通过PCR directly试剂直接提取虫草菌DNA，提取的DNA可直接用于扩增DNA序列片段。
[0007]有益效果：实现微量虫草菌的DNA快速提取，减少DNA序列片段鉴定虫草菌的时间及减少样本使用量。
具体实施方式
[0008]下面对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明，但本专利技术并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本专利技术权利要求所要求保护的范围。
[0009]实施例1(1) 蛹虫草DNA提取液a的制备：取供试品孢子或组织微量，加入真菌DNA Pcr
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directly缓冲液50μL；水浴温度为75℃的条件下处理20min，14000转速离心，取上清液。
[0010](2) 蛹虫草DNA提取液b的制备：使用商用DNA提取试剂盒提取相同供试品的DNA。
[0011](3) 以步骤(1)和(2)中提取的DNA为模板，使用ITS4/ ITS5引物对如下进行PCR扩增反应：ITS4：5
′‑
GGTGAGAGATTTCTGTGC
‑3′
ITS5：5
′‑
TCCTCCGCTTATTGATATGC
‑
3其中，PCR反应体系为：PrimeSTAR Max Premix 12.5μL，1μM的ITS4、ITS5引物各1μL，50ng/μL的模板DNA量为2μL，无菌双蒸水补足至25μL；PCR反应参数为：95℃预变性3min；95℃变性1min，51℃退火45s，72℃延伸1min，32轮；最后72℃延伸10min。
[0012](4)琼脂糖凝胶电泳分析：若提取液a和b电泳结果出现相同的单一DNA条带，则提取液a中含有与b相同的DNA。
[0013]实施例2（1）蝉花DNA提取液a的制备：取供试品孢子或组织微量，加入真菌DNA Pcr
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directly缓冲液50μL；水浴温度为75℃的条件下处理20min，14000转速离心，取上清液。
[0014]（2）蝉花DNA提取液b的制备：使用商用DNA提取试剂盒提取同步骤（1）中的供试品的DNA。
[0015]（3）以步骤(1)和(2)中提取的DNA为模板，使用ITS4/ ITS4引物对如下进行PCR扩增反应：ITS4：5
′‑
GGTGAGAGATTTCTGTGC
‑3′
ITS5：5
′‑
TCCTCCGCTTATTGATATGC
‑3′
其中，PCR反应体系为：PrimeSTAR Max Premix 12.5μL，1μM的ITS4、ITS5引物各1μL，50ng/μL的模板DNA量为2μL，无菌双蒸水补足至25μL；PCR反应参数为：95℃预变性3min；95℃变性1min，51℃退火45s，72℃延伸1min，32轮；最后72℃延伸10min。
[0016]（4）琼脂糖凝胶电泳分析：若提取液a和b电泳结果出现相同的单一DNA条带，则提取液a中含有与b相同的DNA。
[0017]实施例3（1）冬虫夏草DNA提取液a的制备：取供试品孢子或组织微量，加入真菌DNA Pcr
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directly缓冲液50μL；水浴温度为75℃的条件下处理20min，14000转速离心，取上清液。
[0018]（2）冬虫夏草DNA提取液b的制备：使用商业DNA提取试剂盒提取同步骤（1）中的供试品的DNA。
[0019]（3）以步骤(1)和(2)中提取的DNA为模板，使用引物对如下进行PCR扩增反应：NS1（5
′‑
GTAGTCATATGCTTGTCTC
‑3′
）NS4（5
′‑
CTTCCGTCAATTCCTTTAAG
‑3′
）
其中，PCR反应体系为：PrimeSTAR Max Premix 12.5μL，1μM的NS1、NS4引物各1μL，50ng/μL的模板DNA量为2μL，无菌双蒸水补足至25μL；PCR反应参数为：95℃预变性3min；95℃变性1min，52℃退火50s，72℃延伸1min，32轮；最后72℃延伸10min。
[0020]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速提取微量虫草菌DNA的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、取微量虫草菌孢子或组织置于2ml离心管内；二、向步骤一离心管中加入50μL真菌DNA Pcr
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【专利技术属性】
技术研发人员：文庭池，龙凤瑶，张艳，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：