基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化方法及试剂盒，所述的试剂盒包括提取试剂组分、硫化试剂组分和纯化试剂组分；所述的提取试剂组分包括裂解液、提取漂洗液；所述的硫化试剂组分包括转化液、结合液和DNA保护液；所述的纯化试剂组分由洗涤液、磁珠、纯化漂洗液和洗脱缓冲液组成；所述的转化液由重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、四乙基氯化铵和尿素中的一种或多种组成；所述的结合液由胍盐、Tris

【技术实现步骤摘要】
基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因检测
，进一步来说，涉及表观遗传学基因检测，具体涉及一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]随着癌症发病率和死亡率的不断增加，肺癌已经成为中国人群死亡的首要原因和主要的公共健康问题。根据国家癌症中心统计，2019年里恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91％，肺癌是世界上发病率及死亡率最高的恶性肿瘤。我国75％的肺癌患者在诊断时已属晚期，5年生存率仅为15％～16％。在众多的研究中发现，cfDNA(也称血浆游离DNA或游离DNA)存在于晚期而且甚至存在于早期阶段的癌症患者的血浆/血清和外周血中。继续对其研究，发现cfDNA在疾病早期诊断、预后、检测等领域发挥着重要的作用，尤其在免疫性疾病诊疗、癌症筛查与治疗等方面具有较高价值。而且与组织样本相比，cfDNA检测具有无创和易获得的优势，比如对晚期癌症患者进行基因检测、药效评估等均可用cfDNA进行检测。伴随着cfDNA在临床医疗中的广泛应用，对cfDNA的提取提出了更高的要求。
[0003]DNA甲基化是表型修饰的一种，与癌症的发生密切相关。近年来的大量研究表明，DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。如Septin9和(或)SDC2的甲基化与结直肠癌的发生密切相关，SHOX2基因甲基化与肺癌的发生密切相关；EMX1和(或LRRC4)的甲基化与肝癌密切相关。通过检测这些癌症标志物的甲基化水平可实现癌症的无创检测，提高癌症的早期发现率。
[0004]目前实际应用中，cfDNA的提取主要还是以手工提取为主，该方法手不仅工作量大，易出错，而且提取转化的最终效果易受人为因素等方面的影响，无法满足现有的检测需求。目前市场上已有不少自动核酸提取平台，如：Roche、Chiron、Abbott以及国内许多公司均开发出了全自动核酸提取仪器，但这些仪器的配套试剂主要为病毒核酸、基因组核酸或其它长片段核酸提取为主，鲜有基于自动化核酸提取平台的cfDNA提取试剂。亚硫酸盐转化试剂如QIAGEN和ZYMO公司的试剂全部以手动操作为主，导致后续的基因检测如qPCR检测均需要设置复孔才能保证检测结果的准确性，而国内如安徽为臻公司和北京博尔诚公司开发的基于自动核酸提取硫化仪器的核酸提取或亚硫酸氢盐纯化试剂，其操作仍不能实现全自动操作，部分试剂需要手工添加，得到的亚硫酸盐纯化DNA浓度低、稳定性差，很难满足下游的基因检测的需求。
[0005]因此，急需研发设计一种基于自动化提取硫化一体机的配套检测试剂进而满足后续的表观遗传学(基因)检测需求。

技术实现思路

[0006]针对现有应用中鲜有基于全自动提取硫化一体机的配套cfDNA提取和亚硫酸氢盐纯化试剂的技术瓶颈问题，本专利技术提供了一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化方法及试剂盒。
[0007]为了实现以上目的，本专利技术采用的技术方案为：一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，包括提取试剂组分、硫化试剂组分和纯化试剂组分；
[0008]所述的提取试剂组分包括裂解液、提取漂洗液；
[0009]所述的硫化试剂组分包括转化液、结合液和DNA保护液；
[0010]所述的纯化试剂组分由洗涤液、磁珠、纯化漂洗液和洗脱缓冲液组成。
[0011]进一步的，所述的裂解液由蛋白变性剂、核酸保护剂、螯合剂和pH缓冲剂组成。
[0012]再进一步的，所述的蛋白变性剂包括胍盐；所述的核酸保护剂由水溶性维生素、DTT、Carrier RNA和NaF中的一种或多种组成；所述的螯合剂由EDTA和(或)EDTA
‑
3K组成；所述的pH缓冲剂由磷酸盐缓冲液、Tris
‑
HCl缓冲液和柠檬酸盐缓冲液中的一种或多种组成。
[0013]进一步优选的，所述的胍盐为3M～4M的盐酸胍或者异硫氰酸胍；所述的核酸保护剂包括5％～10％的水溶性维生素和(或)5％DTT和(或)0.01％～0.02％的NaF和(或)1ug/mL的Carrier RNA；所述的螯合剂包括5mM～50mM的EDTA和(或)5mM～50mM的EDTA
‑
K3；所述的pH缓冲剂为100mM的Tris
‑
HCl(pH8.0)缓冲液。
[0014]进一步的，所述的提取漂洗液由胍盐、Tris
‑
HCl(pH8.0)和EDTA组成。
[0015]再进一步的，所述的提取漂洗液由终浓度为1M～2M的盐酸胍和(或)异硫氰酸胍和10mM～50mM的Tris
‑
HCl(pH8.0)和2mM～20mM的EDTA(pH8.0)组成。
[0016]进一步的，所述的转化液由重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、四乙基氯化铵和尿素中的一种或多种组成；所述的结合液由胍盐、Tris
‑
HCl和结合增强剂中的一种或多种组成；所述的DNA保护液由对苯二酚、6
‑
羟基
‑
2,5,7,8
‑
四甲基苯并二氢吡喃
‑2‑
羧酸、NaF、四氢呋喃糠醇和咪唑烷基脲的一种或多种组成。
[0017]再进一步的，所述的转化液由4M～7M的亚硫酸氢钠和(或)亚硫酸氢铵和(或)四乙基氯化铵和(或)尿素；所述的胍盐由终浓度为1M～2M的盐酸胍和(或)异硫氰酸胍；所述的Tris
‑
HCl为10mM～50mM的Tris
‑
HCl(pH8.0)；所述的结合增强剂为Carrier RNA和(或)特异性的捕获序列；
[0018]进一步优选的，所述的结合增强剂为浓度为1ug/mL Carrier RNA和100nmol/L的特异性捕获序列；所述特异性捕获序列位于目的基因片段的上游或者下游，且特异性捕获序列与目的基因片段的5
’
端间隔2bp～20bp，捕获序列片段大小为15bp～50bp，C碱基含量为10％～30％，Tm值在55℃～70℃之间，对引物探针序列无交叉影响。
[0019]进一步优选的，所述的DNA保护液由5％～10％的对苯二酚、6
‑
羟基
‑
2,5,7,8
‑
四甲基苯并二氢吡喃
‑2‑
羧酸、NaF、四氢呋喃糠醇和咪唑烷基脲的一种或多种组成。
[0020]进一步的，所述的洗涤液由75％～80％的乙醇组成；所述的磁珠为粒径大小为300nm～800nm的硅羟基磁珠；所述的纯化漂洗液由10mM～50mM的Tris
‑
Hcl(pH8.0)的70％～80％的乙醇组成；所述的洗脱缓冲液由10mM的Tris
‑
HCl(pH8.0)和2mM的EDTA(pH8.0)组成。
[0021]再进一步优选的，所述的磁珠粒径大小为500nm的硅羟基磁珠。
[0022]本专利技术还提供了一种基于提取硫化一体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，包括提取试剂组分、硫化试剂组分和纯化试剂组分；其特征在于：所述的提取试剂组分包括裂解液、提取漂洗液；所述的硫化试剂组分包括转化液、结合液和DNA保护液；所述的纯化试剂组分由洗涤液、磁珠、纯化漂洗液和洗脱缓冲液组成；所述的转化液由重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、四乙基氯化铵和尿素中的一种或多种组成；所述的结合液由胍盐、Tris
‑
HCl和结合增强剂中的一种或多种组成；所述的DNA保护液由对苯二酚、6
‑
羟基
‑
2,5,7,8
‑
四甲基苯并二氢吡喃
‑2‑
羧酸、NaF、四氢呋喃糠醇和咪唑烷基脲中的一种或多种组成；其中，所述的结合增强剂为Carrier RNA或特异性的捕获序列中的一种或两种组成。2.根据权利要求1所述的基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，其特征在于：所述的裂解液由蛋白变性剂、核酸保护剂、螯合剂和pH缓冲剂组成。3.根据权利要求2所述的基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，其特征在于：所述的蛋白变性剂包括胍盐；所述的核酸保护剂由水溶性维生素、DTT、Carrier RNA和NaF中的一种或多种组成；所述的螯合剂由EDTA、EDTA
‑
3K中的一种或多种组成；所述的pH缓冲剂由磷酸盐缓冲液、Tris
‑
HCl缓冲液和柠檬酸盐缓冲液中的一种或多种组成。4.根据权利要求3中所述的基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，其特征在于：蛋白变性剂的胍盐为3M～4M的盐酸胍或者异硫氰酸胍；所述的核酸保护剂为5％～10％的水溶性维生素、5％DTT、0.01％～0.02％的NaF、1ug/mL的Carrier RNA中的一种或多种组成；所述的螯合剂包括5mM～50mM的EDTA、5mM～50mM的EDTA
‑
K3中一种或多种；所述的pH缓冲剂为100mM的Tris
‑
HCl(pH8.0)缓冲液。5.根据权利要求1中所述的基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，其特征在于：所述的提取漂洗液由胍盐、Tris
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HCl(pH8.0)和EDTA组成。6.根据权利要求5中所述的基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，其特征在于：所述的提取漂洗液由终浓度为1M～2M的盐酸胍和/或异硫氰酸胍、10mM～50mM的Tris
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HCl(pH8.0)、2mM～20mM的EDTA(pH8.0)组成。7.根据权利要求1中所述的基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，其特征在于：所述的结合增强剂为浓度为1ug/mL Carrier RNA和100nmol/L的特...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文干，韦玉军，王娟，桂林，朱丽君，夏阳春，李成俊，
申请(专利权)人：安徽安龙基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：