一种获得针对lncRNALOC157273的siRNA钓取方法技术

为克服现有LncRNA的siRNA的筛选、鉴定技术存在可靠性差和筛选成本高的问题，本发明专利技术提供了一种获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，包括以下操作步骤：获取不同的lncRNA LOC157273基因片段；将多个lncRNA LOC157273基因片段分散结合至基板表面，制作基因芯片；制备靶向lncRNA LOC157273基因的siRNA探针文库；将基因芯片与siRNA探针文库进行杂交；采用基因芯片扫描仪对杂交后的基因芯片进行扫描，确定发生杂交的阳性点；对基因芯片上的阳性点进行PCR，扩增纯化得到发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段；对发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段进行测序获知其基因序列，根据发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段的基因序列反向推导出siRNA序列。本发明专利技术提供的siRNA钓取方法从实验入手，更方便和精准地钓取lncRNA的靶siRNA,其结果可靠、准确、全面。全面。全面。

【技术实现步骤摘要】
一种获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法


[0001]本专利技术属于生物制药
，具体涉及一种获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法。

技术介绍

[0002]LncRNA占人类总基因数的一半以上，在许多疾病的调节过程中发挥关键作用，超过95％的疾病相关GWAS SNPS位于非编码区。
[0003]2型糖尿病(T2D)是世界范围内不断增长的疾病，由多种因素与胰岛素敏感性和分泌途径的遗传易感性相互作用而产生，从而增加风险(Knowler等人，2000年)。1981年；Narayan等人，2006年；Cauchi等人，2008年)。对T2D及其危险因素的遗传决定因素的研究揭示了超过400个常见的变异，这些变异位于250多个编码和调控基因组位点，影响了T2D病理生理学的多个不同方面(Manning等人，2012；Wessel等人，2015；Fuchsberger等人，2016；Mahajan等人，2018a，b)。在15年的全基因组关联发现提供了丰富的位点和变异与T2D风险及其潜在的代谢病理生理学。T2D的遗传结构主要是由非编码的、调节性的、主要是常见的变异控制的，仅有的变异能令人信服地证明在欧洲人中直接编码蛋白质改变突变。(富克斯伯格等人，2016年；马哈扬等人，2018年a)。这几百种非编码变异体的功能正被基因组关联数据和基因组功能信息的整合所阐明；对于T2D，到目前为止大多数数据来自胰岛染色质调控图谱。(Pasquali等人，2014年；van de Bunt等人，2015年；Varshney等人，2017年)。与GWAS信号相关的胰岛基因组调控功能包括：增强子位点破坏(Roman等人，2017年)，拉伸增强子增强(Kycia等人，2018年)，以及人类的lncRNA突变(Akerman等人，2017年)等。肝脏、肌肉和脂肪组织的T2D病理生理学，在这方面也取得了进展，将人类组织特异性调控图与GWAS信号联系起来(Scott等人，2016；Pan等人，2018)。在人类肝细胞的lncRNA LOC157273是转录在GWAS发现的chr8p23.1“PPP1R3B”位点，通过沉默lncRNA LOC157273基因可用于调控体内葡萄糖向糖原转化(Leonard Lipovich和Alisa K.Manning等人，2020年)。然而，如何基于lncRNA LOC157273基因设计siRNA却存在着一定的问题。
[0004]在LncRNA的siRNA的筛选、鉴定
，目前的技术手段可以分为三类：1.生物信息学方法：用生物信息学手段进行预测，采用各种线上或线下软件，对其分子的相互作用进行分析。2.siRNA文库杂交实验的方法：采用大规模siRNA文库与目标LncRNA进行杂交，以从中钓取相应的siRNA。3.逐段实验法：这类方法就是穷举所有可能靶向目标LncRNA的siRNA，逐个实验，从而筛选出相应的siRNA的方法。在这些技术手段中，1.生物信息学手段：优点是简单快速，成本较低，能进行高通量操作。缺点和面临的问题是，可靠性很差，需要用实验手段再验证，从而极大的增加了筛选和鉴定的成本和难度。2.siRNA文库杂交实验的方法：这个本质上是一个随机碰撞实验，目前现有的大规模siRNA文库虽然很大，但是具体到每个lncRNA，能配上的概率非常小，因此该方法存在许多不确定性。3.逐段实验法：这类方法是穷举法，由于需要逐个实验，工作量就十分巨大，费时，效率极低，成本极高。

技术实现思路

[0005]针对现有LncRNA的siRNA的筛选、鉴定技术存在可靠性差和筛选成本高的问题，本专利技术提供了一种全新的获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，克服了上述技术方法的缺陷，为后续治疗性药物的开发奠定了基础。
[0006]本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
[0007]本专利技术提供了一种获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，包括以下操作步骤：
[0008]步骤一：以lncRNA LOC157273基因为模板，获取不同的lncRNA LOC157273基因片段；
[0009]步骤二：将多个lncRNA LOC157273基因片段分散结合至基板表面，制作基因芯片；
[0010]步骤三：制备靶向lncRNA LOC157273基因的siRNA探针文库；
[0011]步骤四：将基因芯片与siRNA探针文库进行杂交；
[0012]步骤五：采用基因芯片扫描仪对杂交后的基因芯片进行扫描，确定发生杂交的阳性点；
[0013]步骤六：对基因芯片上的阳性点进行PCR，扩增纯化得到发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段；
[0014]步骤七：对发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段进行测序获知其基因序列，根据发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段的基因序列反向推导出siRNA序列。
[0015]可选的，所述步骤一包括以下操作：
[0016]通过PCR扩增获得lncRNA LOC157273基因；
[0017]通过RD-PCR技术对lncRNA LOC157273基因进行有序分离，得到多种不同的lncRNA LOC157273基因片段。
[0018]可选的，所述“通过PCR扩增获得lncRNA LOC157273基因”包括以下操作：
[0019](1)特异性引物的设计合成：
[0020]上游引物：ATTCATTCCACAAACATTTCTAAGTG
[0021]下游引物：CTTTATTTGAAGACAACAAACGTACAG
[0022](2)获取LncRNA LOC157273cDNA：
[0023]提取并纯化人转录组RNA，利用上述的特异性引物，通过逆转录，获得LncRNA LOC157273cDNA；
[0024](3)PCR扩增：用高保真酶扩增LncRNA LOC157273基因；
[0025](4)连接载体并测序：
[0026]将得到的LncRNA LOC157273基因连接到载体上，转化入感受态细胞内，增殖并测序鉴定。
[0027]可选的，所述“通过RD-PCR技术对lncRNA LOC157273基因进行有序分离，得到多种不同的lncRNA LOC157273基因片段”包括以下操作：
[0028](1)采用限制性内切酶消化lncRNA LOC157273基因；
[0029](2)设计合成RD-PCR通用接头和引物：通用接头序列为5
’-
pGATC，SIP：5
’-
pGATCCACACCAGCCAAACCCA-3
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，SIR：5
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GGTTTGGCTGGTGTG-3
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；通用引物M：GTTTGGCTGGTGTGGATC；在通用引物的3<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，其特征在于，包括以下操作步骤：步骤一：以lncRNA LOC157273基因为模板，获取不同的lncRNA LOC157273基因片段；步骤二：将多个lncRNA LOC157273基因片段分散结合至基板表面，制作基因芯片；步骤三：制备靶向lncRNA LOC157273基因的siRNA探针文库；步骤四：将基因芯片与siRNA探针文库进行杂交；步骤五：采用基因芯片扫描仪对杂交后的基因芯片进行扫描，确定发生杂交的阳性点；步骤六：对基因芯片上的阳性点进行PCR，扩增纯化得到发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段；步骤七：对发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段进行测序获知其基因序列，根据发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段的基因序列反向推导出siRNA序列。2.根据权利要求1所述的获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，其特征在于，所述步骤一包括以下操作：通过PCR扩增获得lncRNA LOC157273基因；通过RD-PCR技术对lncRNA LOC157273基因进行有序分离，得到多种不同的lncRNA LOC157273基因片段。3.根据权利要求2所述的获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，其特征在于，所述“通过PCR扩增获得lncRNA LOC157273基因”包括以下操作：(1)特异性引物的设计合成：上游引物：ATTCATTCCACAAACATTTCTAAGTG下游引物：CTTTATTTGAAGACAACAAACGTACAG(2)获取LncRNA LOC157273 cDNA：提取并纯化人转录组RNA，利用上述的特异性引物，通过逆转录，获得LncRNA LOC157273 cDNA；(3)PCR扩增：用高保真酶扩增LncRNA LOC157273基因；(4)连接载体并测序：将得到的LncRNA LOC157273基因连接到载体上，转化入感受态细胞内，增殖并测序鉴定。4.根据权利要求2所述的获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，其特征在于，所述“通过RD-PCR技术对lncRNA LOC157273基因进行有序分离，得到多种不同的lncRNA LOC157273基因片段”包括以下操作：(1)采用限制性内切酶消化lncRNA LOC157273基因；(2)设计合成RD-PCR通用接头和引物：通用接头序列为5
’-
pGATC，SIP：5
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pGATCCACACCAGCCAAACCCA-3
’
，SIR：5
’-
GGTTTGGCTGGTGTG-3
’
；通用引物M：GTTTGGCTGGTGTGGATC；在通用引物的3
’
端分别延伸不同的碱基得到多个RD-PCR的选择性引物；(3)连接通用接头：取经过限制性内切酶处理和纯化得到的酶切片段与通用接头混合，加入T4连接酶，将酶切片段与通用接头连接；(4)RD-PCR：取上一步获得的反应液作为模板，加入不同配对的选择性引物，进行多组
PCR循环，切胶纯化；最终得到多组纯净的限制性LncRNA LOC157...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑文岭，王卫中，张晓松，孙其喆，莱昂纳多，
申请(专利权)人：深圳市大鳄生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：