针对乙肝病毒的双特异性抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种针对乙肝病毒的双特异性抗体，以及相关的核苷酸序列、表达载体和宿主细胞。本发明专利技术还提供了包含所述双特异性抗体的药物组合物以及相应的制药用途。的药物组合物以及相应的制药用途。

【技术实现步骤摘要】
针对乙肝病毒的双特异性抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及病毒免疫领域。更具体地，本专利技术涉及一种针对乙型肝炎病毒的双特异性抗体及其应用。

技术介绍

[0002]乙型肝炎病毒感染，尤其是慢性HBV感染是全球最为重要的公共卫生问题之一(Dienstag JL.Hepatitis B virus infection.N Engl J Med 2008；359(14)：1486-1500)。慢性HBV感染可导致慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)、肝硬化(Liver cirrhosis，LC)和原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)等一系列肝脏疾病(Liaw YF，Chu CM.Hepatitis B virus infection.Lancet 2009；373(9663)：582-592)。据报道，目前全球约有超过3.5亿的慢性乙型肝炎病毒感染者，这些感染者最终死于HBV感染相关肝脏疾病的风险可达15％-25％，全球每年超过100万人死于此类疾病。
[0003]直到目前，临床上对慢性乙型肝炎的治疗仍面临着过多的困扰。虽然治疗的总体目标是明确的，即逐渐地长期抑制或消除HBV，继而消除肝细胞凋亡坏死及纤维化，延缓和预防疾病的进展等，但在实施过程中还存在着许多困难和争议。HBV的持续存在和复制是导致病情进行性发展的主要原因，因此抗病毒治疗是关键手段，尽管核苷(酸)类似物有了长足的发展，但由于HBV的突变变异，HBV DNA可能与宿主基因的整合以及重组共价封闭DNA(cccDNA)难以清除等因素，以致抗病毒治疗存在着不彻底性。
[0004]基于免疫学手段发展新的治疗慢性HBV感染的药物是此领域的重要研究方向之一。慢性HBV感染的免疫治疗通常通过主动免疫治疗(其对应药物形式如疫苗等)和被动免疫治疗(其对应药物形式如抗体等)等两种方式来进行。主动免疫治疗是指，通过施用治疗性疫苗(包括蛋白疫苗、多肽疫苗和核酸疫苗等)，刺激慢性HBV感染者机体主动产生针对HBV的细胞免疫应答(CTL效应等)或/和体液免疫应答(抗体等)，从而达到抑制或清除HBV的目的。被动免疫治疗(以抗体为例)则是指，向HBV感染者被动施用具有治疗特性的抗体，并利用抗体介导的病毒中和作用阻断HBV感染新生肝细胞，或利用抗体介导的免疫清除作用清除体内病毒和被感染的肝细胞，从而起到治疗的效果。目前，从预防性乙型肝炎疫苗免疫应答者或HBV感染恢复者血清/血浆中纯化获得的Anti-HBs多克隆抗体，即高效价的乙肝免疫球蛋白(HBIG)已广泛应用于阻断HBV的母婴垂直传播、预防慢性HBV感染者肝移植后的HBV再感染、以及预防意外暴露于HBV的人群的感染。然而，其存在例如高效价血浆来源较少、价格昂贵、性质不稳定、潜在的安全性问题等诸多局限性。
[0005]因此迫切需要研发一种安全有效和相对可控的生物制品替代人乙肝免疫球蛋白。因单克隆抗体具有特异性强，灵敏度高且易扩大生产等优点，故需研发针对乙肝表面抗原(乙型肝炎表面抗原，HBsAg)的抗体，以期能够安全有效地阻止HBV感染及其相关的肝炎、肝硬化及肝癌的进程。
[0006]此外，由于疾病的多因素性，单一靶点治疗往往不能满足临床的需求。双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，其能在靶细
胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能，在免疫治疗中具有广阔的应用前景。
[0007]使用双特异性抗体重定向免疫效应细胞T细胞以便靶向杀死肿瘤细胞已经显示出了可观的临床前和临床前景(参见，例如，Topp等人，2012，Blood 120：5185-87；Bargou等人，2008，Science 321：974-77)。迄今为止所开发的双特异性抗体含有对用于T细胞募集和活化的CD3具有特异性的第一结合位点和所靶向的疾病相关联抗原如CD19的第二结合位点(Bassan，2012，Blood 120：5094-95)。双特异性抗体使CD3+T细胞与所靶向的疾病细胞直接接触并且诱导细胞介导的细胞毒性(Bassan，2012)。已经报告抗-CD3X抗-CD 19双特异性抗体可在患有MRD+ALL的大约70％成年患者中以极低浓度来产生完全并且持久的分子缓解(Topp等人，2012，Blood 120：5185-87)。此外，免疫效应细胞重定向BsAb不限于T细胞。包含针对NK细胞抗原CD16a和肿瘤相关的抗原(例如，CD19、CD22、CD33)的scFv的双特异性杀灭衔接子也显示出有效的抗癌活性(例如，Miller，Hematology Soc Hematol Educ Pogram 2013：247-53)。由此可见，包含特异性识别免疫细胞表面抗原的第一功能域以及特异性识别治疗靶标抗原的第二功能域的双特异性抗体设计可增强免疫细胞对治疗靶标的识别，增加免疫细胞与靶标的接触时间，有效增强免疫细胞对肿瘤等靶标的杀伤作用。
[0008]然而，针对乙型肝炎病毒进行基于T细胞/NK细胞重导向的双特异性抗体设计尚无报道。因此，本领域存在对于针对乙型肝炎病毒的双特异性抗体的需求。

技术实现思路

[0009]为解决上述技术问题，在一个方面中，本专利技术提供了一种针对乙肝病毒的双特异性抗体，其包含：
[0010]1)特异性识别免疫细胞表面抗原的第一功能域；以及
[0011]2)特异性识别乙肝病毒表面抗原的第二功能域。
[0012]在一个优选实施方式中，所述免疫细胞为NK细胞或T细胞。
[0013]在进一步的实施方式中，当所述免疫细胞为NK细胞时，免疫细胞表面抗原为CD16a；当所述免疫细胞为T细胞时，免疫细胞表面抗原为CD3、CD2、CD5、CD28和/或CD44。在一个优选实施方式中，免疫细胞表面抗原为CD16a或CD3。
[0014]在一个优选实施方式中，所述特异性识别乙肝病毒表面抗原的第二功能域是通过筛选得到的高亲和力、高活性抗HBsAg单克隆抗体株。
[0015]在进一步的实施方式中，所述筛选方法包括以下步骤：
[0016]a)采用超高流速流式分选系统分离接种乙肝疫苗的志愿者外周血中HBsAg特异的记忆性B细胞，并制备成单细胞样本；
[0017]b)采用Single Cell RT-PCR技术克隆每个样本中抗体相关基因，体外重组表达相应抗体；
[0018]c)经过功能表位测定、亲和力测定和/或中和HBV活性测定，筛选出高亲和力、高活性抗HBsAg单克隆抗体株。
[0019]在另一方面中，本专利技术提供了一种编码本专利技术所述双特异性抗体的核苷酸序列，其包含：编码特异性识别免疫细胞表面抗原的第一功能域的核苷酸序列；以及编码特异性识别乙肝病毒表面抗原的第二功能域的核苷酸序列。
[0020]在另一方面中，本专利技术提供了包含本专利技术所述核苷酸序列的表达载体。在一个优选实施方式中，所述表达载体包含所述核苷酸序列，以及与所述核苷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对乙肝病毒的双特异性抗体，其包含：1)特异性识别免疫细胞表面抗原的第一功能域；以及2)特异性识别乙肝病毒表面抗原的第二功能域。2.权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述免疫细胞为NK细胞或T细胞。3.权利要求2所述的双特异性抗体，其中当所述免疫细胞为NK细胞时，免疫细胞表面抗原为CD16a；当所述免疫细胞为T细胞时，免疫细胞表面抗原为CD3、CD2、CD5、CD28和/或CD44。4.权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述特异性识别乙肝病毒表面抗原的第二功能域是通过筛选得到的高亲和力、高活性抗HBsAg单克隆抗体株。5.权利要求4所述的双特异性抗体，其中所述筛选方法包括以下步骤：a)采用超高流速流式分选系统分离接种乙肝疫苗的志愿者外周血中HBsAg特异的...

【专利技术属性】
技术研发人员：瞿镕，
申请(专利权)人：中以海德人工智能药物研发股份有限公司，
类型：发明
国别省市：