本发明专利技术为一种抗PD-1及c-Met抗原的小分子双特异性抗体Diabody，属生物技术领域，涉及一种双特异性抗体，以及该双特异性抗体的制备方法、应用和相应的核酸编码序列。本发明专利技术提供了一种双特异性抗体,它含有特异性识别T淋巴细胞PD-1抗原的第一功能域和特异性识别肿瘤细胞c-Met抗原的第二功能域。本发明专利技术的双特异性抗体具有单链开口式二聚化结构，能够优先结合肿瘤细胞表面的c-Met抗原，再通过结合T细胞表面的负性共刺激分子PD-1，在肿瘤周围募集T细胞，同时避免肿瘤细胞表面上调的PD-L1发挥抑制作用，促进T细胞激活，对肿瘤产生持续性杀伤。双特异性抗体具有双靶点亲和力差异及小分子特性，在实体瘤中能达到更高的药物暴露水平，在增强杀伤作用的同时降低对正常组织的毒性。性。
【技术实现步骤摘要】
一种抗PD-1及c-Met抗原的小分子双特异性抗体Diabody
[0001]本专利技术属生物
，涉及一种双特异性抗体。本专利技术还包括该双特异性抗体的制备方法、应用以及相应的核酸编码序列。
技术介绍
[0002]肿瘤的传统治疗手法包括手术、放疗和化疗,手术切除的效果常受限于癌细胞入侵蔓延到邻近组织或远端转移，而放化疗则对体内其他正常组织具有较大毒性。免疫治疗是目前肿瘤治疗的新方向，它能通过调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而有效地杀伤肿瘤细胞，具有持久性疗效、适应症广、治疗方式较轻松且能防止转移和复发等优势，甚至为常规治疗无效的晚期肿瘤患者带来了长期生存的希望。目前热门的免疫疗法主要包括免疫检查点抑制剂治疗、过继性免疫细胞治疗、细胞因子治疗与免疫疫苗等。
[0003]PD-1属于免疫球蛋白超家族,是一种能够抑制T细胞激活的免疫检查点分子，肿瘤细胞能够通过上调其配体PD-L1的表达对T细胞产生抑制效应，因此，PD-1抑制剂代表着肿瘤免疫疗法开发策略上一个重要的转变。当前免疫检查点抑制剂遇到的主要困境是总体缓解率相对较低，临床数据显示PD-1单克隆抗体单药治疗实体瘤仅有10-30％左右的响应率。对此可行的方法即采用联合用药增强其疗效，比如联合放疗、化疗和靶向治疗，然而研究发现联合用药可导致副作用增加近4倍以上。
[0004]c-Met是MET基因编码的具有自主磷酸化活性的跨膜受体，属于酪氨酸激酶受体超家族，是HGF的特异性受体。HGF过表达、MET基因过表达、突变和扩增均可使其下游信号通路激活，从而促进肿瘤细胞的生长、增殖和迁移，在肿瘤的发生发展中发挥着关键作用。目前针对此靶点的药物主要有c-Met小分子抑制剂和单克隆抗体，小分子抑制剂在药物的特异性和有效性方面表现优秀，但常常具有较高副作用及剂量限制性毒性，c-Met单克隆抗体的毒性鲜有报道，但其疗效也因其复杂的激活机制而受到限制。
[0005]双特性抗体是肿瘤免疫治疗的一个新方向，它能通过靶向两种不同的抗原，克服Fc限制将T细胞与肿瘤细胞衔接以对其进行集中性杀伤，理论上双特异性抗体能起到“1+1>2”的作用。双特异性抗体按照结构可分为两大类：含Fc区的双特异性抗体(IgG-like双特异性抗体)与不含Fc区的双特异性抗体(non-IgG-like双特异性抗体)。分子量较大的IgG-like双特异性抗体具有更高的亲和力且半衰期较长，小分子的non-IgG-like双特异性抗体半衰期较短，但其组织渗透性极强，具有更大的分布容积，有效剂量不到普通抗体的百分之一，故具有更高的安全性。
[0006]实体瘤及有形瘤，瘤体生长较血液系统肿瘤更为集中，具有复杂的肿瘤微环境，比如可以通过生成特殊结构的肿瘤血管抑制免疫细胞的浸润等。普通激活型双特异性抗体通过输液进入外周血后可能会过早的结合外周T细胞，且由于免疫抑制微环境无法有效到达肿瘤周围发挥作用，还可能由于外周T细胞的激活产生全身性的免疫因子释放，疗效降低的同时具有很大的安全隐患。并且其双功能特性也具有产生更高副作用的风险。因此在确定双特异性抗体靶点选择的同时，还需要对其结构进行改造，设计出合理的双特异性抗体结
构，在增强其杀伤作用的同时降低其副作用。
[0007]蛋白质结构的解析对其功能的理解至关重要。然而由于技术的限制，运用实验的方法解析蛋白质结构投入大、周期长、风险大。同源建模技术可以很好的解决这些问题，蛋白质三级结构的保守性远远超过一级结构的保守性，因此可利用信息技术直接从一级结构预测其高级结构。分子对接是一种预测蛋白质相互识别以及相互作用的技术，基于能量优化来实现蛋白质对接运算。故可通过蛋白质同源建模、优化及对接技术来对双特异性抗体的结构进行辅助设计，并对其结构合理性进行评估。
技术实现思路
[0008]本专利技术要解决的技术问题是提供一种同时识别c-Met和PD-1的双特异性抗体。
[0009]本专利技术要解决的另一个技术问题是将上述双特异性抗体应用于制备抗肿瘤药物。
[0010]基于上述问题，本专利技术公开了一种能够结合肿瘤相关抗原c-Met和T细胞免疫检查点分子PD-1的双特异性抗体。所述双特异性抗体靶向肿瘤细胞上的抗原c-Met，基于c-Met复杂的激活机制所导致的c-Met单克隆抗体用药限制的问题，本专利技术通过衔接T细胞来促进其杀伤作用。实验表明，T细胞激活后可分泌IFN-γ促使肿瘤上调PD-L1来抑制T细胞的激活，所述双特异性抗体同时可靶向T细胞上的PD-1抗原，有效地避免了现有激活型双特异性抗体药物可能引起的进一步免疫抑制作用，而导致肿瘤杀伤作用降低。同时c-Met功能域也赋予了PD-1功能域肿瘤特异性，以此提升PD-1抗体的响应率。本专利技术基于上述构思完成。
[0011]一方面，本专利技术提供了一种双特异性抗体,它包含特异性识别T淋巴细胞PD-1抗原的第一功能域和特异性识别肿瘤细胞c-Met抗原的第二功能域，亦称为Diabody。
[0012]该双特异性抗体包括抗体轻重链可变区及Gly4Ser连接肽。
[0013]本专利技术的双特异性抗体含有抗PD-1抗体轻链可变区单元，较好的，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0014]本专利技术的双特异性抗体含有抗PD-1抗体重链可变区单元，较好的，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0015]本专利技术的双特异性抗体含有抗c-Met抗体轻链可变区单元，较好的，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0016]本专利技术的双特异性抗体含有抗c-Met抗体重链可变区单元，较好的，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0017]本专利技术的双特异性抗体含有Gly4Ser连接肽，较好的，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0018]本专利技术的双特异性抗体中，分别将抗PD-1及c-Met抗体的轻重链可变区交叉配对并通过Gly4Ser连接肽进行连接。
[0019]本专利技术的双特异性抗体中，抗PD-1VH的N末端连接于抗c-Met VL的C末端，抗c-Met VH的N末端连接于抗PD-1VL的C末端，最后通过Gly4Ser连接肽形成柔性肽将抗PD-1VH的C末端连接于其VL的N末端。
[0020]在本专利技术的一个优选例中，所述的Gly4Ser连接肽有3个单元。
[0021]本专利技术的双特异性抗体中，两端抗c-Met轻重链聚合形成二聚化抗c-Met可变区，中间部位形成抗PD-1scFv。
[0022]较好的，本专利技术的双特异性抗体具有开口式二聚化结构，与肿瘤抗原c-Met具有更高的结合能力，故形成具有双靶点亲和力差异的单链小分子双特异性抗体Diabody。
[0023]本专利技术提供了该双特异性抗体的制备方法，包括：
[0024]设计所述的双特异性抗体；
[0025]利用计算机蛋白质同源建模、优化和对接技术辅助设计。
[0026]较好的，该制备方法还包括评估双特异性抗体的结构与合理性。...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种双特异性抗体,其特征在于，包含特异性识别T淋巴细胞PD-1抗原的第一功能域和特异性识别肿瘤细胞c-Met抗原的第二功能域。2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，该双特异性抗体包括抗体轻重链可变区及Gly4Ser连接肽。3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，抗PD-1抗体轻链可变区单元的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，抗PD-1抗体重链可变区单元的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，抗c-Met抗体轻链可变区单元的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。6.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，抗c-Met抗体重链可变区单元的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。7.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，Gly4Ser连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。8.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，分别将抗PD-1及c-Met抗体的轻重链可变区交叉配对并通过Gly4Ser连接肽进行连接。9.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，抗PD-1 VH的N末端连接于抗c-Met VL的C末端，抗c-Met VH的N末端连接于抗PD-1 VL的C末端，最后通过Gly4Ser连接肽形成柔性肽将抗PD-1 VH的C末端连接于其VL的N末端。10.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的Gly4Ser连接肽有3个单元。11.根据权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，两端抗c-Met轻重链聚合形成二聚化抗c-Met可变区，中间部位形成抗PD-1scFv。12....
【专利技术属性】
技术研发人员：于敏，袁庆云，王羽雄，莫炜，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：
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