RNA建库方法技术

本申请提供了一种RNA建库方法。该建库方法包括：利用poly(dT)与ploy(A)的结合捕获富集mRNA；对mRNA进行片段化处理，得到片段化mRNA；对片段化mRNA进行逆转录，得到片段化双链cDNA；对片段化双链cDNA进行文库构建，得到降解RNA测序文库。通过利用poly(dT)与ploy(A)结合的方式富集mRNA后，先对富集的mRNA进行片段化处理，然后逆转录合成双链cDNA，之后利用经典的末端修复加A和TA碱基连接方式建库，提高对降解RNA的兼容性，使得该建库方法能够适合任意样本的RNA文库构建。该建库方法对降解RNA文库构建及产出数据质量的提高效果更显著。

【技术实现步骤摘要】
RNA建库方法
本申请涉及测序文库构建领域，具体而言，涉及一种RNA建库方法。
技术介绍
RNA-seq是研究真核生物转录组基因表达的重要工具，近年来出现的绝对定量RNA-seq建库方法和试剂盒可通过对逆转录后的cDNA分子加入分子标签(UniqueMoleculeidentifier,UMI)来校正因PCR扩增产生的偏好性，达到准确定量转录组基因表达的效果；同时，也可纠正测序过程产生的错误碱基。但是，目前的方法和试剂盒对RNA质量要求很高，降解的RNA样本很难保证测序数据的质量。比如，武汉康测科技的绝对定量试剂盒，该试剂盒要求RNA的RIN值须达到7，琼脂糖电泳28S:18S比例要大于1.5，无拖带等。其原理通过逆转录引物(ReverseTranscription,RT)在逆转录过程引入PCR上游位点；随后，通过单链分子间连接的方式在cDNA第一链引入UMI和PCR下游位点；最后，通过PCR扩增和纯化完成文库构建。可见，目前现有的试剂盒并不适用于降解或RIN值较低的RNA样本，产生的测序结果往往存在重复数据占比高(Dup率高)、有效数据占比低(CleanReads低)且含有大量的接头污染等问题，特别是大规模核酸提取过程中，在很难保证获得高纯度、高RIN值RNA的情况下，上述方法或试剂盒并不适用于产业化测序建库的需求。申请内容本申请的主要目的在于提供一种RNA建库方法，以解决现有技术中解决产业化测序建库中现有方法不适合降解RNA样本建库测序的问题。为了实现上述目的，根据本申请的一个方面，提供了一种RNA建库方法，该建库方法包括：利用poly(dT)与ploy(A)的结合捕获富集mRNA；对mRNA进行片段化处理，得到片段化mRNA；对片段化mRNA进行逆转录，得到片段化双链cDNA；对片段化双链cDNA进行文库构建，得到降解RNA测序文库。进一步地，采用带poly(dT)的磁珠对总RNA中的mRNA进行捕获富集，得到磁珠-mRNA复合物；优选地，总RNA为存在降解的总RNA，更优选为RIN值≤7的总RNA。进一步地，利用poly(dT)与ploy(A)的结合捕获富集mRNA包括：将总RNA样本在第一温度下(优选为60～68℃，更优选为65℃)变性以打开二级结构；随后，将带poly(dT)的磁珠与打开二级结构后的总RNA混合，得到混合物；在第二温度(优选为20～27℃，更优选为25℃)下使得poly(dT)与ploy(A)结合从而对mRNA进行第一次捕获；在第三温度(优选78～85℃，更优选为80℃)下使磁珠释放第一次捕获的产物；将释放第一次捕获的产物之后的磁珠进行处理(即加入结合缓冲液)后，再次使poly(dT)与ploy(A)结合从而对mRNA进行二次捕获。进一步地，对mRNA进行片段化处理，得到片段化mRNA包括：将磁珠-mRNA复合物与片段化缓冲液在90～95℃下孵育打断，得到片段化mRNA；优选地，孵育打断的时间为10～20min。进一步地，对片段化双链cDNA进行文库构建，得到降解RNA测序文库包括：对片段化双链cDNA进行末端修复加A，得到修复DNA；对修复DNA连接带分子标记的接头，得到连接产物；对连接产物进行PCR扩增，得到降解RNA测序文库。进一步地，带分子标记的接头为双端带有分子标记的Y型接头。进一步地，Y型接头包括接头1和接头2，接头1的序列如SEQIDNO：1所示，接头2的序列如SEQIDNO：2所示。进一步地，带分子标记的接头中的分子标记为4～8nt的随机核酸序列，任意2个Y型接头至少一端的分子标记不同；优选地，分子标记为表2中的任一种。进一步地，在对连接产物进行PCR扩增之前，建库方法还包括对连接产物进行片段筛选的步骤；优选采用磁珠进行片段筛选。进一步地，对片段化mRNA进行逆转录，得到片段化双链cDNA包括：对片段化mRNA进行逆转录合成第一链cDNA；采用含dUTP的dNTP，合成第二链cDNA，得到片段化双链cDNA；优选地，在对连接产物进行PCR扩增之前，采用USER酶对连接产物进行消化处理，以去除含U碱基的第二链cDNA。应用本申请的技术方案，通过利用poly(dT)与ploy(A)结合的方式富集mRNA后，先对富集的mRNA进行片段化处理，然后逆转录合成双链cDNA，之后利用经典的末端修复加A和TA碱基连接方式建库，提高对降解RNA的兼容性，使得该建库方法能够适合任意样本的RNA文库构建。该建库方法对降解RNA文库构建及产出数据质量的提高效果更显著。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1示出了本申请的降解RNA文库构建方法的流程示意图；图2示出了本申请实施例中不同物种的测序数据中同一reads分子数的统计结果；图3示出了本申请实施例中的人源样本降解情况的凝胶电泳图；图4示出了本申请实施例中H7667样本库检结果；图5示出了本申请实施例中H7672样本库检结果；图6示出了本申请实施例中H7740样本库检结果；图7示出了本申请实施例中H7617样本库检结果。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本申请。针对现有技术所存在的情况，本专利技术研究了一种适用于降解或低RIN值(比如RIN值在7以下的降解样本)RNA样本测序的绝对定量建库方法，该方法建库的各项数据结果同正常或高RIN值样本无差异，适合大规模核酸提取得到的不同质量RNA样本测序建库，符合产业化测序建库需求。在该研究结果的基础上，申请人提出了本申请的方案。在一种优选的实施例中，提供了一种RNA建库方法，该建库方法包括：利用poly(dT)与ploy(A)的结合捕获富集mRNA；对mRNA进行片段化处理，得到片段化mRNA；对片段化mRNA进行逆转录，得到片段化双链cDNA；对片段化双链cDNA进行文库构建，得到降解RNA测序文库。本申请所提供的RNA建库方法，在利用poly(dT)与ploy(A)结合的方式富集mRNA后，先对富集的mRNA进行片段化处理，然后逆转录合成双链cDNA，之后利用经典的末端修复加A和TA碱基连接方式建库，提高对降解RNA的兼容性，使得该建库方法能够适合任意样本的RNA文库构建。该建库方法对降解RNA文库构建及产出数据质量的提高效果更显著。在一种优选的实施例中，采用带poly(dT)的磁珠对总RNA中的mRNA进行捕获富集，得到磁珠-mRNA复合物。具体的磁珠种类可以是已有产品，比如ABClonal的试剂盒(RK20302)。在一种优选的实施例中，利用poly(dT)与ploy(A)的结合捕获富集mRNA包括：在第一温度下对总RNA进行变性，然后将带poly(dT)的磁珠与总RNA混本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RNA建库方法，其特征在于，所述建库方法包括：/n利用poly(dT)与ploy(A)的结合捕获富集mRNA；/n对所述mRNA进行片段化处理，得到片段化mRNA；/n对所述片段化mRNA进行逆转录，得到片段化双链cDNA；/n对所述片段化双链cDNA进行文库构建，得到降解RNA测序文库。/n

【技术特征摘要】
1.一种RNA建库方法，其特征在于，所述建库方法包括：
利用poly(dT)与ploy(A)的结合捕获富集mRNA；
对所述mRNA进行片段化处理，得到片段化mRNA；
对所述片段化mRNA进行逆转录，得到片段化双链cDNA；
对所述片段化双链cDNA进行文库构建，得到降解RNA测序文库。


2.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，利用poly(dT)与ploy(A)的结合捕获富集mRNA包括：
采用带poly(dT)的磁珠对总RNA中的mRNA进行捕获富集，得到磁珠-mRNA复合物；
优选地，所述总RNA为存在降解的总RNA，更优选为RIN值≤7的总RNA。


3.根据权利要求2所述的建库方法，其特征在于，利用poly(dT)与ploy(A)的结合捕获富集mRNA包括：
将所述总RNA在第一温度下变性以打开二级结构；
将所述带poly(dT)的磁珠与打开二级结构后的所述总RNA混合，得到混合物；
将所述混合物置于第二温度下使所述poly(dT)与ploy(A)结合以对mRNA进行第一次捕获；
将完成第一次捕获后的所述磁珠置于第三温度下以释放第一次捕获的产物；
将释放第一次捕获的产物后的所述磁珠进行处理后，再次使所述poly(dT)与ploy(A)结合，以对mRNA进行第二次捕获；
优选地，所述第一温度为60～68℃，更优选为65℃；
优选地，所述第二温度为20～27℃，更优选为25℃；
优选地，所述第三温度为78～85℃，更优选为80℃。


4.根据权利要求2或3所述的建库方法，其特征在于，对所述mRNA进行片段化处理，得到片段化mRNA包括：
将所述磁珠-mRNA复合物与片...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新，马玉，李瑞强，赵桂仿，
申请(专利权)人：天津诺禾致源生物信息科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12