一种高通量筛选α-酮酸高产菌株的方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量筛选α‑酮酸高产菌株方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术对来源于奇异变形杆菌的L‑氨基酸脱氨酶PmiLAAD进行蛋白质工程改造，并使用高通量筛选的方法，在96孔板中培养含奇异变形杆菌的L‑氨基酸脱氨酶PmiLAAD的重组菌株及菌株突变体，并进行转接诱导，离心收集含奇异变形杆菌的L‑氨基酸脱氨酶PmiLAAD的细胞来转化L‑氨基酸(L‑缬氨酸、L‑甲硫氨酸及L‑苯丙氨酸)生成其对应的α‑酮酸，并利用2,4‑二硝基苯肼显色后于520nm处读取吸光值，并将吸光值大的菌株进行摇瓶验证，筛选得到α‑酮酸产量显著提高的菌株。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量筛选α-酮酸高产菌株的方法
本专利技术涉及一种高通量筛选α-酮酸高产菌株的方法，属于生物工程

技术介绍
酮酸是一类具有生物活性的有机酸，同时酮酸也是分子中同时含有羧基和酮基的双官能团的有机化合物，α-酮酸是羧基在α碳原子上的酮酸。α-酮酸是有机化合物药物合成及生物合成的重要中间体，已广泛用于医药、化学合成、化妆品、饲料和食品领域，是一类在生物体内拥有重要作用的有机酸。目前，α-酮酸主要生产方法为化学合成法，主要为羰基化法、格氏试剂法以及海因法，但是，羰基化法虽具有原料易得、反应步骤短、产物较易分离等优点，反应体系中单羰基化和双羰基化反应相互竞争，反应温度、CO的压力及卤代烃、醇、碱催化剂和溶剂种类对二者的选择均有很大的影响，该法虽然制备步骤较短，产物后提取简单，但是催化剂的制备及重复使用有一定难度；格氏试剂合成方法采用的格氏试剂反应大大缩短了反应时间及反应步骤，应用范围广，产率较高，产品纯度好，但是需要在无水、无氧、低温条件下进行，并且以易燃易爆的乙醚为溶剂，反应条件较难控制使得此反应很难实现工业化；而海因法虽然原料本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量筛选α-酮酸高产菌株的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：/n(1)以携带编码野生型L-氨基酸脱氨酶的基因的质粒为模板，针对特定位点进行饱和突变，并将携带编码L-氨基酸脱氨酶突变体的基因的质粒转入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；/n(2)选择TBA发酵培养基，高通量培养重组大肠杆菌，并通过低温诱导重组大肠杆菌表达L-氨基酸脱氨酶突变体；所述TBA发酵培养基的成分按g/L计：蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，葡萄糖0.5，α-一水合乳糖4，(NH

【技术特征摘要】
1.一种高通量筛选α-酮酸高产菌株的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)以携带编码野生型L-氨基酸脱氨酶的基因的质粒为模板，针对特定位点进行饱和突变，并将携带编码L-氨基酸脱氨酶突变体的基因的质粒转入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；
(2)选择TBA发酵培养基，高通量培养重组大肠杆菌，并通过低温诱导重组大肠杆菌表达L-氨基酸脱氨酶突变体；所述TBA发酵培养基的成分按g/L计：蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，葡萄糖0.5，α-一水合乳糖4，(NH4)2SO43.3，KH2PO46.8，Na2HPO4·12H2O7.1，MgSO4，0.15；
(3)收集表达L-氨基酸脱氨酶突变体的重组大肠杆菌，以全细胞作为催化剂，高通量转化L-氨基酸得到α-酮酸，转化结束后，将上清液与2,4-二硝基苯肼显色剂进行显色反应，并使用酶标仪读取显色反应液的吸光度，吸光值越大，相应菌株的α-酮酸的产量越高；
(4)将通过2,4-二硝基苯肼显色反应筛选得到的高产菌株利用摇瓶发酵实验进行产量验证。


2.根据权利要求1所述的一种高通量筛选α-酮酸高产菌株的方法，其特征在于，步骤(1)利用蛋白质工程改造策略对L-氨基酸脱氨酶PmiLAAD进行蛋白质工程改造，设计L-氨基酸脱氨酶PmiLAAD突变体，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET-28a为表达载体。


3.根据权利要求1所述的一种高通量筛选α-酮酸高产菌株的方法，其特征在于，将种子液过夜培养并转接至装有TBA发酵培养基的对应位置的96孔板中，发酵条件为37℃、750-900rpm，培养至OD600为0.6～1.0时，将温度降至25℃诱导宿主细胞生产L-氨基酸脱氨酶。


4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴静，武耀运，宋伟，周怡雯，陈修来，刘佳，高聪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32