重组鼠Tet3蛋白原核表达及其稳定性研究制造技术

发明专利技术名称重组鼠Tet3蛋白原核表达及其稳定性研究摘要本发明专利技术公开了重组鼠Tet3蛋白原核表达及其稳定性研究的研究成果，探讨了重组蛋白在液体保存状态下温度对其稳定性影响的问题。通过分子克隆技术，将鼠Tet3基因克隆至原核表达载体pET28a(+)上，成功构建重组质粒pET28a‑Tet3；再对重组蛋白表达条件进行优化，分离纯化出目的蛋白Tet3；对纯化出的目的蛋白Tet3稳定性进行分析，主要选取3个温度条件即常温、4℃和37℃，分别保存60天来分析Tet3蛋白在液体保存状态下的稳定性。本发明专利技术能表达纯化出高纯度高品质的重组鼠Tet3蛋白，并验证出重组鼠Tet3蛋白在液体状态保存条件下最优的保存温度，为公司产品在运输过程中的最佳保存条件提供一个好的理论依据。

【技术实现步骤摘要】
重组鼠Tet3蛋白原核表达及其稳定性研究
本专利技术涉及分子生物学与蛋白质组学领域，具体的是说重组鼠Tet3蛋白原核表达及其稳定性研究。技术背景DNA的胞嘧啶(C)5-甲基化是一种重要的表观修饰，它参与基因调节、基因组印记、X-染色体失活、重复序列抑制和癌症发生等过程。5-甲基胞嘧啶(5mC)可被TET(ten-eleventranslocation)蛋白家族进一步转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，该过程是DNA去甲基化的1个必要阶段。5hmC可在活性转录基因起始位点和Polycomb抑制基因启动子延伸区域富集。TET蛋白包括3个成员TET1、TET2和TET3，均属于α-酮戊二酸和Fe2+依赖的双加氧酶，其催化涉及氧化过程。小鼠Tet1在胚胎干细胞发育中拥有双重作用，即促进全能因子的转录，又参与发育调节因子的抑制。人TET蛋白的破坏与造血系统肿瘤相关，如在骨髓增生性疾病/肿瘤存在频繁的TET2基因突变。TET蛋白和5hmC的研究为DNA甲基化/去甲基化及其生物学功能提供了新的视点。原核表达系统（大肠杆菌表达系统）是基因表达技术中发展最早，应用最广泛的经典表达系统，近几十年，大肠杆菌表达系统也不断得到发展和完善，被科研及工业用户大量用于各种重组蛋白表达。与其它表达系统相比，具有目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强，成本相对低等特点。亲和层析是利用生物大分子与某些相对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离生物大分子的层析方法。亲和层析是目前生产上应用最为广泛的分离纯化蛋白的方法之一，表达载体pET28a(+)上带有6HIS标签，可以应用镍纯化树脂分离纯化目的蛋白。通过选取3个温度条件来摸索重组鼠Tet3蛋白在液体保存状态下的稳定性，对产品在运输过程中能否保持其稳定性提供很好的参考，也为公司重组蛋白产品在运输过程中的最佳保存条件提供理论依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是能表达纯化出高纯度高品质的重组鼠Tet3蛋白，并验证出重组鼠Tet3蛋白在液体状态保存条件下最优的保存温度，为公司产品在运输过程中的最佳保存条件提供一个好的理论依据。技术方案包括以下步骤：（1）人工合成鼠Tet3基因，Tet3和pET28a(+)经BamHl和Xhol双酶切后连接，构建重组质粒pET28a-Tet3。（2）然后用CaCl2法将重组质粒分别转化到原核表达宿主Rosetta(DE3)和C41(DE3)中，构建工程菌。（3）构建好的工程菌用IPTG诱导表达，并从诱导温度和IPTG浓度两个方面对目标蛋白可溶性表达进行优化。（4）用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白。（5）探讨温度对重组鼠Tet3蛋白稳定性的影响。所述步骤（1）中，查阅NCBI数据库中鼠Tet3基因转录本，人工合成鼠Tet3基因，然后将pET28a(+)和Tet3基因经BamHl、Xhol双酶切，通过连接转化构建pET28a-Tet3。所述步骤（2）中，将重组质粒分别转化到原核表达宿主Rosetta(DE3)和C41(DE3)中，目的是为了筛选目的基因最适合的表达宿主。所述步骤（3）中，分别从诱导温度和IPTG浓度两个方面对目标蛋白的可溶性表达进行优化，诱导温度分别采用了16℃、25℃、30℃、37℃，IPTG浓度分别采用了0.1mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM。收集不同诱导条件下的细菌，超声破碎后分别取上清和沉淀，SDS-PAGE电泳检测目标蛋白可溶性表达情况。镍柱纯化蛋白原理是：组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响。组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体上的镍离子带正电对组氨酸有亲和作用。高浓度的咪唑可以竞争性地与镍柱结合，从而使组氨酸与镍柱脱附，达到分离纯化目的蛋白的作用。所述步骤（5）中，选取了三个温度条件即常温、4℃和37℃，分别保存60天，挑取其中的24个样本电泳检测来分析Tet3蛋白在液体保存状态下的稳定性。经实验证实，经过对重组蛋白表达条件进行优化，能表达纯化出高纯度高品质的重组鼠Tet3蛋白；且探索并验证出重组鼠Tet3蛋白在液体状态保存条件下最优的保存温度和时间。本专利技术先通过查阅NCBI数据库中鼠Tet3基因转录本，将目标蛋白基因克隆至表达载体上；通过对目标蛋白的表达条件进行一系列优化，最终得到一组最优条件：诱导温度为16℃，IPTG浓度为0.6mM，诱导时间为12h。经大体积发酵后能纯化出高纯度高品质的重组鼠Tet3蛋白。选择3个温度条件验证出重组鼠Tet3蛋白在液体状态保存条件下最优的保存温度，为公司产品在运输过程中的最佳保存条件提供一个好的理论依据。附图说明图1为以PUC57-Tet3为模板，通过PCR扩增出的鼠Tet3基因部分编码区片段，1%琼脂糖凝胶电泳图。图2为构建的重组表达质粒pET28a-Tet3示意图。图3为含重组质粒pET28a-Tet3的大肠杆菌Rosetta(DE3)经不同IPTG浓度诱导后的SDS-PAGE电泳图。注：泳道1、2、3、4、5分别代表蛋白质Marker，未诱导，0.1mMIPTG，0.5mMIPTG，0.8mMIPTG。图4为含重组质粒pET28a-Tet3的大肠杆菌C41(DE3)经不同IPTG浓度诱导后的SDS-PAGE电泳图。注：泳道1、2、3、4、5分别代表蛋白质Marker，未诱导，0.1mMIPTG，0.5mMIPTG，0.8mMIPTG。图5为含重组质粒pET28a-Tet3的大肠杆菌Rosetta(DE3)经不同温度诱导后，超声破碎后上清和沉淀的SDS-PAGE电泳图。注：泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别代表蛋白质Marker，未诱导，16℃上清，16℃沉淀，25℃上清，25℃沉淀，30℃上清，30℃沉淀，37℃上清，37℃沉淀。图6为含重组质粒pET28a-Tet3的大肠杆菌Rosetta(DE3)经不同浓度IPTG诱导后，超声破碎后上清和沉淀的SDS-PAGE电泳图。注：泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别代表蛋白质Marker，未诱导，0.1mM上清，0.1mM沉淀，0.4mM上清，0.4mM沉淀，0.6mM上清，0.6mM沉淀，0.8mM上清，0.8mM沉淀。图7为融合蛋白Tet3的纯化示意图。注：泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别代表蛋白质Marker，穿透液，20mM咪唑，40mM咪唑，60mM咪唑，100mM咪唑，300mM咪唑，500mM咪唑。图8、图9、图10为不同温度保存条件下，液态重组鼠Tet3蛋白稳定性SDS-PAGE电泳检测结果。注：图8表示在常温条件下保存60天液态重组鼠T本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鼠Tet3蛋白克隆至原核表达载体pET28a(+)，其特征在于，包括下述步骤：/n（1）人工合成鼠Tet3基因，Tet3和pET28a(+)经BamHl和Xhol 双酶切后连接，构建重组质粒pET28a-Tet3；/n（2）然后用CaCl2法将重组质粒分别转化到原核表达宿主Rosetta(DE3)和C41(DE3)中，构建工程菌。/n

【技术特征摘要】
1.鼠Tet3蛋白克隆至原核表达载体pET28a(+)，其特征在于，包括下述步骤：
（1）人工合成鼠Tet3基因，Tet3和pET28a(+)经BamHl和Xhol双酶切后连接，构建重组质粒pET28a-Tet3；
（2）然后用CaCl2法将重组质粒分别转化到原核表达宿主Rosetta(DE3)和C41(DE3)中，构建工程菌。


2.如权利要求书1所述的鼠Tet3蛋白克隆至原核表达载体pET28a(+)过程，其特征在于，所述步骤（1）中，查阅NCBI数据库中鼠Tet3基因转录本，人工合成鼠Tet3基因，然后将pET28a(+)和Tet3基因经BamHl、Xhol双酶切，通过连接转化构建pET28a-T...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄娟，李学斌，
申请(专利权)人：伊艾博武汉科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42