一种重组蓝铜肽前体-寡肽的高纯度制备方法技术

本发明专利技术公开一种重组蓝铜肽前体‑寡肽的高纯度制备方法，涉及基因工程领域。该制备方法利用大肠杆菌合成重组多拷贝GHK串联短肽，及酶解法切割释放GHK单体以大量生产GHK单肽。该方法的关键在于(1)利用class‑IIS型限制性核酸内切酶在识别位点下游特定位置切割任意DNA序列的特点，实现短肽的多次串联延长；解决了基因工程表达短肽的低表达量的问题，具有降低生产成本、减轻化学合成中造成的环境负担的优势；(2)无需蛋白纯化柱，简单通过硫酸铵沉淀‑等电点沉淀结合的蛋白纯化方法，即可高效分离纯化酶切获得GHK单体；与GHK标准品具有相同的生物活性，且纯度高、成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种重组蓝铜肽前体-寡肽的高纯度制备方法
本专利技术涉及基因工程领域，特别涉及一种重组蓝铜肽前体-寡肽(GHK)的高纯度制备方法，具体是利用酶切串联多肽制备可用于医疗和护肤的GHK的工艺方法。
技术介绍
蓝铜肽前体-寡肽(GHK)是一种由甘氨酸、赖氨酸和组氨酸三个氨基酸组成的三联体短肽，其在溶液中可以自发地和铜离子结合形成蓝铜胜肽。蓝铜胜肽(GHK-Cu)具有较高的社会价值和经济价值，应用于化妆品中，可以起到减少皱纹以及抗衰老的功效。蓝铜胜肽(GHK-Cu)最初于1973年从人的血浆中分离得到。近年来有人报道，GHK和GHK-Cu可以在纤维原细胞培养液中促进或抑制金属蛋白酶的合成，还能促进多种细胞和组织的生长、分裂和分化。接下来的几年中，人们陆续发现GHK-Cu的多种功能及应用，如：1)抗炎症活性，在最近的研究发现，GHK-Cu复合物可减少TNF-α依赖的IL-6在人类皮肤成纤维细胞中的分泌。由于其抗炎症性质，铜肽可取代类固醇或非固醇类抗炎症药物在皮肤炎症治疗中的作用。其还可以减少紫外线诱导的红斑；2)DNA修复，最近研究表明G本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组蓝铜肽前体-寡肽的高纯度制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)根据class-IIS型限制性内切酶特点和GHK的基因序列，设计引入5′末端磷酸化的互补的引物，构建小肽编码单元；/n(2)小肽编码单元通过自连，延长重复序列，得到串联短肽基因片段；/n(3)将引入了class-IIS型限制性内切酶酶切位点的克隆载体与步骤(2)的串联短肽基因片段连接，将串联短肽基因片段插入至class-IIS型限制性内切酶酶切位点处，得到重组克隆载体；/n(4)将重组克隆载体上的串联短肽基因片段通过酶切连接，连接到表达载体上，获得重组表达载体；/n(5)将步骤(4)所得重组表达载体转入宿主菌中，...

【技术特征摘要】
1.一种重组蓝铜肽前体-寡肽的高纯度制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据class-IIS型限制性内切酶特点和GHK的基因序列，设计引入5′末端磷酸化的互补的引物，构建小肽编码单元；
(2)小肽编码单元通过自连，延长重复序列，得到串联短肽基因片段；
(3)将引入了class-IIS型限制性内切酶酶切位点的克隆载体与步骤(2)的串联短肽基因片段连接，将串联短肽基因片段插入至class-IIS型限制性内切酶酶切位点处，得到重组克隆载体；
(4)将重组克隆载体上的串联短肽基因片段通过酶切连接，连接到表达载体上，获得重组表达载体；
(5)将步骤(4)所得重组表达载体转入宿主菌中，获得表达重组串联重复GHK多肽的重组菌株；
(6)培养重组菌株，诱导重组串联重复GHK多肽的表达；
(7)细胞破碎上清液用60～75％饱和度硫酸铵静置沉淀，取上清调pH至弱碱性，继续静置后继续添加硫酸铵至饱和度80～95％，再次静置，所得沉淀即重组串联重复GHK多肽；
(8)利用蛋白酶切割重组串联重复GHK多肽得到GHK单体。


2.根据权利要求1所述的高纯度制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述class-IIS型限制性内切酶为BbsI或AvaI；
步骤(1)中所述小肽编码单元对应的氨基酸序列为2拷贝的GHK。


3.根据权利要求1或2所述的高纯度制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述小肽编码单元对应的核苷酸序列为：5′-GGTCATAAAGGCCACAAG-3′；
步骤(1)中，所述引物的序列如下：
Tar-F：5′-P-GGTCATAAAGGCCACAAG-3′；
Tar-R：5′-P-GACCCTTGTGGCCTTTAT-3′。


4.根据权利要求1或2所述的高纯度制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所得的重组克隆载体被相同class-IIS型限制性内切酶重复酶切，与步骤(2)的串联短肽基因片段连接，实现串联重复GHK片段不断延长，直至获得足够拷贝的串联重复序列。


5.根据权利要求1或2所述的高纯度制备方法，其特征在于：
步骤(4)中，重组克隆载体上的串联短肽基因片...

【专利技术属性】
技术研发人员：李爽，羊凤铃，朱晁谊，刘政宇，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44