用于体内翻译后修饰的组合物和方法技术

本发明专利技术提供在受试者中翻译后修饰合成蛋白的方法。在一个实施例中，所述方法包含向所述受试者施用包含编码所述合成蛋白的第一重组核酸序列和编码修饰蛋白的第二重组核酸序列的组合物，其中所述修饰蛋白在所述受试者中翻译后修饰合成生物制品。在一个实施例中，所述翻译后修饰是硫酸化，并且所述修饰蛋白选自由酪蛋白磺基转移酶1(TPST1)和TPST2组成的群组。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于体内翻译后修饰的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请享有于2018年6月11日提交的美国临时申请第62/683,344号的优先权，其通过引用以其整体并入本文。
技术介绍
多种蛋白的活性可以通过翻译后修饰来提高。翻译后修饰(PTM)是导致不同官能团共价连接到蛋白上的化学变化。这些修饰可以特异性地将所述蛋白靶向某些细胞途径，改善总体功能和效力，改变稳定性或半衰期，或导致折叠和其他蛋白相互作用的差异。使用DNA质粒已经很好地建立了编码不同靶蛋白的能力。然而，进一步改进这些DNA编码的蛋白的需要是必要的。通过编码可执行翻译后修饰的不同酶，可修饰靶蛋白，并因此改善总体期望结果。该额外的调节步骤允许特异性地定制所编码的蛋白，并且可以用于疫苗以及其他DNA编码的蛋白二者。目前，用作药物的生物制品(抗体、促红细胞生成素、凝血因子)经常在哺乳动物细胞系(CHO)中产生，并且在PTM的位置和程度方面表现出异质性，其中一些可能降低生物制品的功能性(Harris，2005)。因此，具有一种使用先进的DNA/电穿孔(EP)技术来促进这些复杂生物分子的体内递送和修饰的简单方法将是重要优势。
技术实现思路
本专利技术提供了用于在受试者中翻译后修饰合成蛋白的方法。在一个实施例中，该方法包含向受试者施用包含编码合成蛋白的第一重组核酸序列和编码修饰蛋白的第二重组核酸序列的组合物，其中修饰蛋白在受试者中翻译后修饰合成生物制品。在一个实施例中，翻译后修饰选自由硫酸化、乙酰化、N-连接的糖基化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、类泛素化(SUMOylation)、羟基化、甲基化、O-连接的糖基化、泛素化、氧化和棕榈酰化组成的群组。在一个实施例中，翻译后修饰是硫酸化，并且修饰蛋白选自由酪蛋白磺基转移酶1(TPST1)和TPST2组成的群组。在一个实施例中，修饰蛋白是TPST2。在一个实施例中，TPST2包含IgE前导序列。在一个实施例中，TPST2包含与SEQIDNO：5或7至少90％同源的氨基酸序列。在一个实施例中，第二重组核酸序列包含与SEQIDNO：6或8至少90％同源的序列。在一个实施例中，合成蛋白是抗原、抗体或免疫粘附素。在一个实施例中，免疫粘附素是eCD4-Ig。在一个实施例中，eCD4-Ig包含与SEQIDNO：1或3至少90％同源的氨基酸序列。在一个实施例中，第一重组核酸序列包含与SEQIDNO：2或4至少90％同源的序列。在一个实施例中，翻译后修饰是硫酸化，修饰蛋白是酪蛋白磺基转移酶1(TPST2)，并且合成蛋白是eCD4-Ig，其中eCD4-Ig在受试者中被硫酸化。本专利技术还提供了用于在受试者中翻译后修饰合成蛋白的组合物。在一个实施例中，该组合物包含编码合成蛋白的第一重组核酸序列和编码修饰蛋白的第二重组核酸序列。在一个实施例中，修饰蛋白催化合成蛋白上的翻译后修饰(PTM)，其中所述PTM选自由翻译后修饰组成的群组，所述翻译后修饰选自由硫酸化、乙酰化、N-连接的糖基化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、类泛素化、羟基化、甲基化、O-连接的糖基化、泛素化、氧化和棕榈酰化组成的群组。在一个实施例中，翻译后修饰是硫酸化，并且修饰蛋白选自由酪蛋白磺基转移酶1(TPST1)和TPST2组成的群组。在一个实施例中，修饰蛋白是TPST2。在一个实施例中，TPST2包含IgE前导序列。在一个实施例中，TPST2包含与SEQIDNO：5或7至少90％同源的氨基酸序列。在一个实施例中，第二重组核酸序列包含与SEQIDNO：6或8至少90％同源的序列。在一个实施例中，合成蛋白是抗原、抗体或免疫粘附素。在一个实施例中，免疫粘附素是eCD4-Ig。在一个实施例中，eCD4-Ig包含与SEQIDNO：1或3至少90％同源的氨基酸序列。在一个实施例中，第一重组核酸序列包含与SEQIDNO：2或4至少90％同源的序列。在一个实施例中，将一种或多种核酸分子工程化在表达载体中。在一个实施例中，组合物包含药学上可接受的赋形剂。在一个实施例中，本专利技术提供了一种用于治疗有此需要的受试者中的疾病、病症或感染的方法。在一个实施例中，该方法包含向受试者施用本专利技术的组合物。在一个实施例中，该方法包含电穿孔步骤。附图说明包含图1A至图1F的图1描绘了ReCD4-Ig的体外表达和硫酸化。图1A描绘了ReCD4-Ig在归一化至总蛋白浓度的HEK293T细胞的转染裂解物中的表达。图1B描绘了ReCD4-Ig在HEK293T细胞的转染上清液中的表达。图1C描绘了用p-ReCD4-Ig或pVAX(质粒骨架载体)转染的HEK293T细胞上清液的免疫印迹。图1D描绘了检测转染上清液中ReCD4-Ig酪氨酸硫酸化的结合ELISA。图1E描绘了用p-ReCD4-Ig和不同剂量的p-IgE-TPST2转染的HEK293T细胞上清液中ReCD4-Ig的定量。使用成对T检验比较各组与无酶组之间的水平，在1:20IgE-TPST2组中检测到显著降低(p<0.05)。图1F描绘了用单独的p-ReCD4-Ig或p-ReCD4-Ig和1：1000质粒酶转染的HEK293T细胞的上清液的免疫印迹。下图是上样对照，以证明转染上清液中的ReCD4-Ig含量相同。包含图2A至图2C的图2描绘了证明IgE-TPST2的亚细胞靶向的实验结果。图2A描绘了确定TPST2变体(红色)和Golgin97(绿色)之间的定位的共聚焦显微镜。细胞核用DAPI染色(蓝色)。IgE-TPST2与TPST2相比显示增加的至TGN的运输。在最后一图中可以观察到△TM-TPST2的扩散细胞质分布。图2B描绘了用目标区域分析定量TPST2变体和Golgin97之间的定位(n＝16)。使用单因素ANOVA(F统计量＝79.67，p值＜0.0001)和事后成对T检验(Holm调整)来比较不同组之间的皮尔逊相关系数。P值如所示。图2C描绘了用单独的pGX00001骨架质粒，或用pGX00001与质粒编码的酶转染的HEK293T细胞的荧光显微镜图像。三个通道的重叠显示与TPST2和△TM-TPST2相比，IgE-TPST2向TGN的运输增强。包含图3A至图3F的图3描绘了ReCD4-Ig的体内表达和硫酸化。图3A描绘了肌肉匀浆7d.p.i的免疫印迹，证明了与对侧腿相比，IgE-TPST2(43kDa)在注射腿中的表达。GAPDH(37kDa)用作上样对照。图3B描绘了用单剂量DNA注射的瞬时免疫调节的B6.Cg-Foxnlnu/J和balb/c中ReCD4-Ig的血清表达。图3C描绘了确定小鼠血清中ReCD4-Ig酪氨酸硫酸化的结合ELISA。向瞬时耗尽balb/c小鼠注射p-ReCD4-Ig和不同剂量的p-IgE-TPST2；收集血清7d.p.i进行分析。将每组的OD450与无酶和1：20IgE-TPST2组进行比较，以确定硫酸化所需的最小剂量的IgE-TPST2。图3D描绘了在用p-ReCD4-Ig和不同质粒酶剂量7d.p.i共同处理的小鼠中ReCD4-Ig的血清表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在受试者中翻译后修饰合成蛋白的方法，所述方法包含向所述受试者施用包含编码所述合成蛋白的第一重组核酸序列和编码修饰蛋白的第二重组核酸序列的组合物，其中所述修饰蛋白在所述受试者中翻译后修饰合成生物制品。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180611 US 62/683,3441.一种在受试者中翻译后修饰合成蛋白的方法，所述方法包含向所述受试者施用包含编码所述合成蛋白的第一重组核酸序列和编码修饰蛋白的第二重组核酸序列的组合物，其中所述修饰蛋白在所述受试者中翻译后修饰合成生物制品。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述翻译后修饰选自由硫酸化、乙酰化、N-连接的糖基化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、类泛素化、羟基化、甲基化、O-连接的糖基化、泛素化、氧化和棕榈酰化组成的群组。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述翻译后修饰是硫酸化，并且所述修饰蛋白选自由酪蛋白磺基转移酶1(TPST1)和TPST2组成的群组。


4.根据权利要求3所述的方法，其中所述修饰蛋白是TPST2。


5.根据权利要求4所述的方法，其中TPST2包含IgE前导序列。


6.根据权利要求5所述的方法，TPST2包含与SEQIDNO：5或7至少90％同源的氨基酸序列。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二重组核酸序列包含与SEQIDNO：6或8至少90％同源的序列。


8.根据权利要求1所述的方法，其中所述合成蛋白是抗原、抗体或免疫粘附素。


9.根据权利要求8所述的方法，其中所述免疫粘附素是eCD4-Ig。


10.根据权利要求9所述的方法，其中eCD4-Ig包含与SEQIDNO：1或3至少90％同源的氨基酸序列。


11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一重组核酸序列包含与SEQIDNO：2或4至少90％同源的序列。


12.根据权利要求2所述的方法，其中所述翻译后修饰是硫酸化，所述修饰蛋白是酪蛋白磺基转移酶1(TPST2)，并且所述合成蛋白是eCD4-Ig，其中eCD4-Ig在所述受试者中被硫酸化。


13.一种用于在受试者中翻译后修饰合成蛋白的组合物，包含：
(a)编码所述合成蛋白的第一重组核酸序列，和...

【专利技术属性】
技术研发人员：大卫·韦纳，梅甘·怀斯，徐子扬，
申请(专利权)人：威斯塔解剖学和生物学研究所，
类型：发明
国别省市：美国;US