一种甾体C1,2位脱氢酶酶活检测方法技术

本发明专利技术涉及一种甾体C1,2位脱氢酶酶活检测方法。甾体C1,2位脱氢酶能够代谢还原WST

【技术实现步骤摘要】
一种甾体C1,2位脱氢酶酶活检测方法
(一)

[0001]本专利技术涉及一种甾体C1,2位脱氢酶酶活检测方法。
(二)
技术介绍

[0002]甾体化合物，是一类特殊的多元环萜类化合物，通常含有一个由A、B、C和D四个环组成的环戊烷多氢菲母核，其中A、B、C环为完整封闭的六元环，D环为五元环；甾体化合物广泛存在于动物、植物组织和某些微生物中。目前，涉及的反应类型主要有羟基化、氧化、水解、侧链降解、C1,2位脱氢、酯化、还原、异构化以及其他基团的导入等。
[0003]甾酮C1,2位脱氢酶，既是诱导酶、胞内酶，也是一种膜蛋白，其酶蛋白活性中心锚定在细胞内膜上。该蛋白中有两个疏水性氨基酸区段共同组成了它的跨膜区。具有黄素腺嘌呤二核苷酸结合位点。甾酮C1,2位脱氢酶能催化甾体微生物转化中A环发生的C1,2位脱氢反应。KsdD催化反应机理应遵从两步的单分子共轭碱消除(E1cb)理论：首先，3
‑
酮基甾体底物C3位上的酮基与酶的亲电残基发生强烈的相互作用，造成了C
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2(β)氢键的断裂，这个氢原子以质子的形式通过一个广义碱基脱除，形成一个烯醇化物的中间体或者负碳离子的中间体；之后，C1和C2位之间形成一个双键，同时，氢负离子从C1位转移到黄素辅酶。甾体化合物A环C1,2位引入双键后，其抗炎活性能成倍增加。例如，醋酸可的松经C1,2脱氢反应后生成的醋酸波尼松，其抗炎活性增加了3
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4倍；目前临床上许多重要甾体化合物的生产过程中均涉及到微生物的甾体C1,2脱氢反应，包括氢化泼尼松、地塞米松、帕拉米松、倍他米松、曲安西龙、甲基强的松龙等大多数具有抗炎能力的肾上腺皮质激素。
[0004]对于氧化还原酶活性的检测活性的检测可通过加入人工受氢体,包括TTC(2,3,5一氯化三苯基四氮哩)、刃天青、亚甲基蓝、INT(碘硝基四哩紫)等,由人工受氢体的还原变色速率来确定脱氢过程的强度,其中,应用最为广泛的是TTC。TTC在脱氢酶活性检测方法操作过程需加有机试剂,且溶液显色浅,易退色,反应时间长。WST
‑
1是一种类似于MTT的化合物，是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan(甲臢)不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST
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1和XTT、MTS产生的formazan(甲臢)都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST
‑
1产生的formazan(甲臢)比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。再次，WST
‑
1比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST
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1和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。
[0005]目前，甾酮C1,2位脱氢酶活性测试方法中包括主要有PMS
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细胞色素C和PMS
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NBT两种反应体系。PMS
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细胞色素C体系主要为PMS
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细胞色素C法和PMS
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DCPIP法。PMS
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NBT体系主要为PMS
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NBT法。随着近些年人工受氢体四唑盐的不断升级，最新已研制到WST系列(如WST
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1、WST
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8)。并且对于一些常见的脱氢酶(如琥珀酸脱氢酶)已用最新研制的四唑盐建立了相关酶活检测体系，而甾酮C1,2位脱氢酶活性检测方法还停留在初级阶段的四唑盐。所以，有必要针对不同的四唑盐建立最适于甾酮C1,2位脱氢酶活性检测体系。
(三)
技术实现思路

[0006]本专利技术目的本专利技术目的是提供一种甾体C1,2位脱氢酶酶活检测方法。
[0007]本专利技术采用的技术方案是：
[0008]一种甾体C1,2位脱氢酶酶活检测方法，所述方法包括：
[0009](1)将适量甾体C1,2位脱氢酶底物与吩嗪硫酸甲酯、WST
‑
1检测试剂混于缓冲液中；
[0010](2)称取WST
‑
1，加入95％酒精助溶，蒸馏水定容配制成0.4％的WST
‑
1溶液，避光保存；吸取0.4％的WST
‑
1溶液于容量瓶，加入Na2S2O4粉末，摇匀后再用乙酸乙酯定容至刻度；分别取0.25mL、0.5mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到TF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作为参比，在440nm下测定萃取液吸光度，绘制标准曲线；
[0011](3)将含甾体C1,2位脱氢酶的待测溶液加入缓冲溶液，混合均匀，置于甾体C1,2位脱氢酶最适反应温度和最适反应pH值下反应1～4小时，检测440nm的吸光度；
[0012](4)对照甾体C1,2位脱氢酶标准曲线，计算得到待测溶液中甾体C1,2位脱氢酶浓度。
[0013]本专利技术利用WST
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1检测试剂的颜色变化实时监测甾体C1,2位脱氢酶活力，提供了一种甾体C1,2位脱氢酶活力的检测方法。选用WST
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1检测试剂检测体系，甾体C1,2位脱氢酶酶活检测呈现良好的线性剂量关系；通过反应物在440nm的吸光度值，进行甾体C1,2位脱氢酶的活力评价。
[0014]反应原理：WST
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1是一种黄颜色的染料。甾体C1,2位脱氢酶能够代谢还原WST
‑
1，同时在PMS的联合作用下生成还原成水溶性的橙黄色甲臢产物，在440nm下测定吸光度，以WST
‑
1还原量表示脱氢酶活性，根据标准曲线计算橙黄色甲臢的生成量，进而求出甾体C1,2位脱氢酶活性。
[0015]所述的WST
‑
1的化学式为：
[0016][0017]优选的，甾体C1,2位脱氢酶底物与助溶剂混合后再添加至缓冲液中，所述助溶剂为下列之一：DMSO、DMF、吐温80、乙醇。
[0018]反应液中甾体C1,2位脱氢酶底物浓度为10～100mM，吩嗪硫酸甲酯的浓度为5～25μM，WST
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1的浓度为10～100mM。待测溶液中甾酮C1,2位脱氢酶酶活检测范围为10mU/L～100mU/L。优选的，所述甾体C1,2位脱氢酶底物可为雄烯二酮或胆固醇、甘氨胆酸、牛磺胆
酸、薯蓣皂苷等，优选为雄烯二酮(AD)。
[0019]所述甾体C1,2位脱氢酶最适反应温度为30℃～40℃，最适反应pH值为8.0～10.0。
[0020]所述含甾体C1,2位脱氢酶的待测溶液可为含甾体C1,2位脱氢酶的菌液，来自放线菌门、变形菌门或厚壁菌门等。
[0021]本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术针对现有技术的缺点，如细胞毒性、对具有抗氧化性药物的假阳性反应，提供了一种甾体C1,2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甾体C1,2位脱氢酶酶活检测方法，所述方法包括：(1)将适量甾体C1,2位脱氢酶底物与吩嗪硫酸甲酯、WST
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1检测试剂混于缓冲液中；(2)称取WST
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1，加入95％酒精助溶，蒸馏水定容配制成0.4％的WST
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1溶液，避光保存；吸取0.4％的WST
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1溶液于容量瓶，加入Na2S2O4粉末，摇匀后再用乙酸乙酯定容至刻度；分别取0.25mL、0.5mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到TF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作为参比，在440nm下测定萃取液吸光度，绘制标准曲线；(3)将含甾体C1,2位脱氢酶的待测溶液加入缓冲溶液，混合均匀，置于甾体C1,2位脱氢酶最适反应温度和最适反应pH值下反应1...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，倪叶雯，张博，陈鑫鑫，柯霞，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：