一种化学诱导皮质神经元的方法及培养基技术

本发明专利技术涉及神经元诱导技术领域，具体公开了一种化学诱导皮质神经元的方法及培养基，该培养基为不使用动物血清，也不含有动物源成分的化学诱导体系，包括无血清基础培养基及一种分泌酶抑制剂。本发明专利技术诱导方法化学成分明确，分化效率高。而且，所获的的人源皮质神经元具有免疫原性低，分化时间短，以及电生理活性稳定的特点。与目前国际通行的血清加小分子组合的诱导方法相比，本发明专利技术完全免除了在细胞培养过程中动物源性成分的存在带来的潜在危险，尤其适合使用于神经系统疾病药物的体外筛选，及神经退行性疾病的治疗，因此具有巨大的经济效应和社会效应。应和社会效应。应和社会效应。

【技术实现步骤摘要】
一种化学诱导皮质神经元的方法及培养基


[0001]本专利技术属于神经元诱导
，具体涉及一种化学诱导皮质神经元的方法及培养基。

技术介绍

[0002]外胚层是胚胎发育过程中形成的最外层，随着器官发生的开始，外胚层细胞逐渐分化为大脑，脊髓，感觉器官等重要的系统。其中神经系统是负责思维，情感，感知，运动等功能的重要系统。外胚层细胞的与多种退行性疾病的发生相关，例如神经退行性疾病有神经元的老化死亡而产生，是目前常见的老龄化疾病，该疾病的治疗及护理费用极其昂贵，而且市面上无特效药物可以进行有效的治疗。神经退行性疾病包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森病(PD)、阿尔茨海默症(AD)等疾病。神经退行性疾病和脊髓损伤的研究难点在于中枢神经系统的神经细胞具有不可再生性，体外疾病模型的稀缺是基础研究的限制性因素，而这类疾病是由于中枢神经的不可逆损伤造成。神经细胞包括神经干细胞，成熟神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等不同神经细胞类型。不同细胞类型的研究可以揭示疾病的发生机制和发展过程。研究发育过程的细胞分化是病理研究的基础。通过了解正常细胞的分化发育过程，了解调控干细胞分化的基因，将有助于洞悉疾病的形成原因，并研发相应的疾病治疗策略。以皮质神经细胞为例，其中大脑皮质覆盖于大脑两半球的灰质，是高级神经活动的物质基础，由神经元、神经纤维及神经胶质构成。其中皮质神经元的病变和损伤涉及到脑卒中，癫痫，是多种中枢神经系统疾病的重要靶向目标。
[0003]目前，相关领域药物研发多使用传统细胞系，使用啮齿目神经细胞系进行药物筛选，不能体现人类对药物的正常反应，目前药物筛选领域的皮质细胞元绝大多数来源于啮齿动物原代细胞，而鼠与人之间存在着明显的种属差异，这也是药物筛选出现偏差的原因之一；此外人源皮质神经元细胞的来源不足，遗体捐赠或者胚胎来源的人源神经干细胞存在均一性差异显著，有伦理使用的限制，且不能满足高通量筛选的工业量级需求；以上因素均大大制约了神经系统药物的开发的准确性和效率。
[0004]2006年，山中伸弥的团队专利技术了一种由OCT4,SOX2,KLF4和c
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Myc四种转录因子构成的“鸡尾酒”法，能够成功将终端分化的皮肤成纤维细胞重编程成为具有分化多能性的干细胞，这种干细胞被称为诱导多能干细胞(induced pluripotent cells)(Cell，2006，124(4)pp.663
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676；Cell，2007，131(5)pp.861
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872)。这些干细胞具有和胚胎干细胞(embryonic stem cells)类似的分化潜能，能够形成人体发育最基本的三个胚层：外胚层，中胚层及内胚层，并最终形成多种成体细胞。这一专利技术突破了在医学上使用人胚胎干细胞的伦理限制。以神经系统为例，目前在再生医学领域，神经干细胞及神经元的诱导多采取SMAD途径双重抑制法(Dual SMAD inhibition)(Chambers SM,et.al.,Nat Biotechnol，2009，27(3):275
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80)，该方法得到的神经干细胞能够分化为其它类型的神经元细胞，其原理是通过抑制BMP和TGFBeta途径来模拟胚胎发育早期的信号途径，从而诱导神经干细胞的产生。其中LDN
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193189和SB431542是广为使用的两种化学小分子抑制剂，分别通过作用于
BMP4途径中的ALK2和ALK3，以及TGFBeta途径中的ALK5来达到移植内胚层及中胚层形成，从而起到诱导外胚层发育及神经发生的作用。通过这种方法，可以在血清类成分(Knockout Serum Replacement)的存在下得到诱导的神经元细胞(Chambers SM,et.al.,Nat Biotechnol.，2013，30(7):715
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720)。这些诱导神经细胞的研究为神经退行性疾病的治疗和药物筛选提供了崭新的思路。
[0005]基于现有技术中存在的技术问题，有必要研究一种化学诱导皮质神经元培养基及诱导方法。

技术实现思路

[0006]鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种化学诱导皮质神经元的方法及培养基，解决现有技术中细胞培养过程中动物源性成分的存在带来的潜在危险，从而适用于神经系统疾病药物的体外筛选，及神经退行性疾病的治疗。
[0007]为解决上述问题，本专利技术方案如下：
[0008]本专利技术提出抑制剂Crenigacestat在诱导神经干细胞分化为皮质神经元细胞中的应用；所述抑制剂Crenigacestat的用量为1
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20μM，优选7.5uM。
[0009]本专利技术还提出一种皮质神经元诱导培养基，包括无血清基础培养基和抑制剂Crenigacestat，抑制剂Crenigacestat的用量为1
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20μM。
[0010]进一步地，所述抑制剂Crenigacestat的用量为7.5uM。
[0011]进一步地，所述无血清基础培养基包括维生素、无机盐、小分子抑制剂、血清替代物以及其他成分；所述维生素包括1ug/ml维生素E，1.2uM维生素B12，64mg/L维生素C；所述无机盐包括1.2g/L碳酸氢钠，0.5g/L氯化钠，13.6μg/L亚硒酸钠；所述小分子抑制剂包括12.5uM LY2157299，5uM JW55；所述其他成分包括12.5ug/ml D(+)
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半乳糖，6.3ng/ml黄体酮，23ug/ml腐胺，20mg/L胰岛素；所述血清替代物为血清白蛋白、转铁蛋白及脂肪酸中的一种或多种，用量为100ng/ml。
[0012]本专利技术还提出利用上述皮质神经元诱导培养基诱导多能干细胞分化为皮质神经元细胞的方法，包括以下步骤：
[0013]1.多能干细胞诱导分化神经干细胞：在无血清基础培养基中对多能干细胞进行单层贴壁培养，诱导培养基贴壁培养，得到形成神经花环状均匀排列的神经干细胞；
[0014]2.神经干细胞诱导分化皮质神经元：将S1所得神经干细胞通过皮质神经元诱导培养基诱导分化得到皮质神经元。
[0015]进一步地，以上方法中，所述贴壁培养中有基底膜制剂，为基底胶，层粘蛋白和玻连蛋白的一种或多种。
[0016]进一步地，以上方法中，所述步骤1还包括鉴定神经干细胞标志物Nestin、ZO
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1、SOX2、PAX6及Nestin以验证神经干细胞的诱导结果。
[0017]进一步地，以上方法中，所述步骤2还包括鉴定皮质神经元表达基因GAD1、GRID1、GRIN1、VGLUT1及VGLUT2以验证皮质神经元的诱导分化结果。
[0018]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0019]1.本专利技术提出一种既不使用动物血清，也不含有动物源成分的人源皮质神经元化学诱导体系，该诱导体系化学成分明确，分化效率高。
[0020]2.本专利技术通过诱导获得的人源皮质神经元具有免疫原性低，分化时间短，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分泌酶抑制剂Crenigacestat在诱导神经干细胞分化为皮质神经元细胞中的应用。2.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂Crenigacestat的用量为1
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20μM。3.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂Crenigacestat的用量为7.5μM。4.一种皮质神经元诱导培养基，其特征在于，包括无血清基础培养基和抑制剂Crenigacestat，抑制剂Crenigacestat的用量为1
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20μM。5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述抑制剂Crenigacestat的用量为7.5μM。6.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述无血清基础培养基包括维生素、无机盐、小分子抑制剂、血清替代物以及其他成分；所述维生素包括1ug/ml维生素E，1.2uM维生素B12，64mg/L维生素C；所述无机盐包括1.2g/L碳酸氢钠，0.5g/L氯化钠，13.6μg/L亚硒酸钠；所述小分子抑制剂包括12.5uM LY2157299，5uM JW55；所述其他成分包括12.5ug/ml D(+)
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【专利技术属性】
技术研发人员：魏君，蔡萌，云轩，
申请(专利权)人：武汉睿健医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：