一种肠激酶活性的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种检测肠激酶活性的方法，包括如下步骤：1）标准品制备：取已知含量的融合蛋白用Tris-HCl溶液系列稀释；2）样品准备：将融合蛋白与待测肠激酶样品加入到酶切缓冲液中，进行酶切反应，然后将体系更换为Tris-HCl溶液，作为待检品；3）样品检测：准备并设置高效液相色谱，取标准品与待检品依次上样；4）数据测定与计算：以各标准品峰面积对各标准品质量拟合标准曲线；将待检品中融合蛋白峰代入标准曲线，计算出待检品中融合蛋白的质量，再计算出待测肠激酶样品的酶比活性。本发明专利技术通过测定肠激酶底物减少量的方式来计算待测肠激酶的酶比活性，并创造性地归纳出新的数学式，来计算肠激酶活性，能够精确且快速检测肠激酶活性的方法。活性的方法。活性的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种肠激酶活性的检测方法


[0001]本专利技术涉及药物分析领域，具体涉及一种肠激酶活性的检测方法。

技术介绍

[0002]由于具有相对较高的特异性和较宽的活性范围，肠激酶是一种理想的用于 处理融合蛋白的工具酶，在重组蛋白的生产中得到广泛使用，在蛋白药物研发中 也起着重要作用。
[0003]目前，肠激酶的活性检测方法主要有两种。
[0004]一种方法基于其天然底物(胰蛋白酶原)即首先使用肠激酶激活胰蛋白酶 原生成胰蛋白酶，胰蛋白酶再与小分子底物反应并检测其产物的吸光值。
[0005]另外一种是基于人工合成的连接了肠激酶识别序列的小分子荧光物质。当 肠激酶从荧光物质上切去识别序列后，体系中有荧光产生，可通过计算一段时间 内荧光强度的增加量得到肠激酶活性。
[0006]上述两种方法都有其局限性：
[0007]第一种方法操作繁琐，且为防止胰蛋白酶自激活，反应需在偏离肠激酶最 适pH的酸性条件下进行，其结果难以反应样品的真实活性；
[0008]第二种方法对仪器要求较高，且部分荧光物质属于危化品，具有较大的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测肠激酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)标准品制备：取已知含量的融合蛋白用Tris-HCl溶液系列稀释；2)样品准备：将融合蛋白与待测肠激酶样品加入到酶切缓冲液中，进行酶切反应，然后将体系更换为Tris-HCl溶液，作为待检品；3)样品检测：准备并设置高效液相色谱，取标准品与待检品依次上样；4)数据测定与计算：以各标准品峰面积对各标准品质量拟合标准曲线；将待检品中融合蛋白峰代入标准曲线，计算出待检品中融合蛋白的质量，再计算出待测肠激酶样品的酶比活性；酶比活性定义为：在25摄氏度下，pH 8.0的缓冲液中每分钟分解1μmol融合蛋白所需的酶量；计算公式如下：2.根据权利要求1所述的检测肠激酶活性的方法，其特征在于，所述的步骤1)中，融合蛋白是具有A-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-B氨基酸残基序列，其中A、B均为由一个以上氨基酸残基组成的序列，且其中A-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys部分与B部分的分子量均比重组蛋白总体分子量小12kDa以上。3.根据权利要求1所述的检测肠激酶活性的方法，其特征在于，所述的步骤1)和2)中，Tris-HCl溶液的pH值为7.5～8.5，Tris的浓度为50mM～100mM。4.根据权利要求1所述的检测肠激酶活性的方法，其特征在于，所述的步骤2)中，酶切缓冲液为包含表面活性剂、变性剂和蛋白稳定剂中的一种或多种的磷酸盐或Tris缓冲液。5.根据权利要求1所述的检测肠激酶活性...

【专利技术属性】
技术研发人员：张弨，
申请(专利权)人：修正生物医药杭州研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：