一种高温生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种高温生物转化制备L‑2‑氨基丁酸的方法，涉及生物化学技术领域，通过热稳定的苏氨酸脱氨酶能将L苏氨酸转化成2‑丁酮酸，再通过亮氨酸脱氢酶及醇脱氢酶转化2‑丁酮酸生成L‑2‑氨基丁酸，所述苏氨酸脱氨酶源于Chryseobacterium takakiae的野生型苏氨酸脱氨酶或其突变体，且所述突变体与SEQ ID NO.2具有90％以上相似性并具有以下特征中的一个或多个突变：H63N，I78V，E202S，R375K，所述苏氨酸脱氨酶突变体的序列为SEQ ID NO.5。利用热稳定的苏氨酸脱氨酶，避免使用甲酸铵引入铵离子，利用热稳定的醇脱氢酶循环辅酶再生，优势在于整个体系不引入无机盐，适用于较高温度下催化L苏氨酸生成2‑丁酮酸再生成L‑2‑氨基丁酸，因此更适合于工业化应用。

【技术实现步骤摘要】
一种高温生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法
本专利技术属于属于生物化学
，尤其涉及一种高温生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法。
技术介绍
L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种非蛋白氨基酸，具有抑制人体神经信息传递，加强葡萄糖磷酸酯酶的活性和促进脑细胞代谢的作用。L-2-氨基丁酸的衍生物(S)-2-氨基丁酰胺可做为新型抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦等手性药物的关键中间体，L-2-氨基丁酸的另一种衍生物(S)-2-氨基丁醇是抑菌抗结核药乙胺丁醇盐酸盐的关键中间体。这些药物的光学纯度对治疗的安全性和有效性至关重要。左乙拉西坦的R-对映体没有抗癫痫活性和(R，R)-形式的安非他命可引起失明。尽管乙胺丁醇和左旋乙拉西坦现在是仿制药，但在许多国家，高昂的药价造成大多数癫痫患者不能使用左乙拉西坦治疗。目前，随着左乙拉西坦等药物专利到期，市场普及程度提高，对其关键中间体L-2-氨基丁酸需求越来越大。L-2-氨基丁酸的生产方法主要有发酵法，化学合成法和生物催化法。发酵法现在存在的最大缺陷是产量低，产品纯度不够。目前的发酵法主要是针对苏氨酸代谢途径进行改造，使得代谢流向2-丁酮酸及-2-氨基丁酸，但报道出的数据均小于50克/升，结合L-2-氨基丁酸的市场价格现状(2018年四季度报价不足15美金)及市场容量(全球市场百吨级)，目前的发酵效价不太具有放大生产的意义。如专利CN201510208576.1中发酵后期要补入100g/L苏氨酸，10g/L谷氨酸，反应实质上仍是全细胞生物催化反应，且产物最高记录仅为57g/L左右，转化率偏低。CN201210015308.4在苏氨酸高产菌株的基础上，通过过表达苏氨酸脱氨酶与亮基酸脱氢酶发酵生成产物，但该方法发酵时间需要60小时，且产物最高记录仅为20g/L。另外微生物发酵过程中会产生大量的代谢产物并且发酵培养基中也会带入大量的有机培养基及无机盐，对分离造成一定程度的影响，进而导致最终产品的纯度及手性纯度低于体外催化途径。如CN201610208600.6专利中，发酵结束后经陶瓷膜，超滤膜过滤后，再经离子交换树脂吸附洗脱，纯度仅为97.3％，仍低于98.5％的普通级L-2-氨基丁酸纯度要求且离子交换树脂的使用对于L-2-氨基丁酸目前的价格并不具有实用意义。化学法合成的产物多为消旋体，需要进一步拆分。另外，化学法需要使用昂贵的试剂，易生成副产物，同时使用多种有机溶剂，进一步增大了环保处理的成本。生物催化法主要有氨基酰化酶法，氨基酸氧化酶法，酰胺酶法，腈水解酶法，转氨酶法和氨基酸脱氢酶法等。其中又以转氨酶法和氨基酸脱氢酶法的催化底物浓度及生产效率较高，目前市场上的生物催化法主要以这两类为主。转氨酶法是指2-丁酮酸在转氨酶的催化作用下合成2-氨基丁酸。利用α转氨酶合成时，由于反应的可逆性仅获得58％～62％的产率，并且该过程复杂，需要引入乙酰乳酸合成酶、丙氨酸外消旋酶和D-氨基酸氧化酶移除副产物。L-2-氨基丁酸还可通过ω-转氨酶以苄胺或异丙胺作为氨基供体合成，该反应不可逆，但目前所报道的ω-转氨酶法普遍底物浓度偏低。专利CN201510900727.X以胺和酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，生产手性胺，但转化浓度偏低，最高的数据仅为46g/L，距离工业放大生产仍有不小差距。氨基酸脱氢酶为目前研究最深入的生物催化途径，专利CN201210066624.4和CN201010139227.6等报道了以L-苏氨酸为原料，先由苏氨酸脱氨酶转化成2-丁酮酸，再由亮氨酸脱氢酶催化2-丁酮酸制备L-2-氨基丁酸，但是CN201210066624.4催化1000g苏氨酸需要用到600g全细胞菌体，发酵成本上不具有生产意义。而CN201010139227.6的辅酶再生系统是葡萄糖，由于葡萄糖用量过大且葡萄糖酸与产物L-2-氨基丁酸的分子量相近，成熟简单的膜分离方法无法有效分离产物与副产物，增大了分离成本；该专利中酶参与的反应不超过30℃，反应温度低，反应速度慢，转化效率低。另外，现存报道中辅酶用量：底物用量几乎都大于1：1000，即实际生产中投入底物1吨至少需要消耗1公斤辅酶，而辅酶价格昂贵(如日本东方酵母进口95％规格NAD价格约为8000元/公斤)间接的增加了L-2-氨基丁酸的生产成本。国内主要的L-2-氨基丁酸供应商采用的是综合性价比较高的苏氨酸脱氨酶，亮氨酸脱氢酶，偶联甲酸脱氢酶进行辅酶的循环使用，但过程中需要与苏氨酸等摩尔量的甲酸铵，且铵离子会一直存在于反应液中，提取结束后产生的大量废液中含有高浓度的铵盐，造成后期的环保成本巨大。专利CN201210066624.4公开了一种L-2-氨基丁酸的生物制备方法，该方法需在甲酸铵、辅酶磷酸吡哆醛的的存在下，在15℃-50℃条件下反应得到L-2-氨基丁酸。一方面该专利中催化1000g苏氨酸需要用到600g全细胞菌体，发酵成本上不具有生产意义；另一方面，引入了甲酸铵。加氨氮浓度质量大于500mg/L属于高浓度氨氮废水，由于NH4+中氮元素的氧化，会造成水体中溶解氧浓度降低，导致水质下降，对水生动植物的生存造成影响。水中氮素含量太多，致使光合微生物(大多数为藻类)的数量增加，即水体发生富营养化现象。因此当有NH4+存在时，水处理厂将需要更大的加氯量，从而增加处理成本。
技术实现思路
本专利技术的目的解决现有技术中在制备L-2-氨基酸过程中需加入甲酸铵引入氨离子，增加环境负担及生产成本的问题，提供一种高效、高产、环保的高温生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法。本专利技术的技术方案如下：一种高温生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，通过热稳定的苏氨酸脱氨酶能将L苏氨酸转化成2-丁酮酸，再通过亮氨酸脱氢酶及醇脱氢酶转化2-丁酮酸生成L-2-氨基丁酸，所述苏氨酸脱氨酶源于Chryseobacteriumtakakiae(藻苔金黄杆菌)的野生型苏氨酸脱氨酶或其突变体，且所述突变体与SEQIDNO.2具有90％以上相似性并具有以下特征中的一个或多个突变：H63N，I78V，E202S，R375K，所述苏氨酸脱氨酶突变体的序列为SEQIDNO.5。优选的，所述苏氨酸脱氨酶或其突变体比大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶具有更高的热稳定性。优选的，反应温度在45℃-60℃。优选的，辅酶循环依赖于醇脱氢酶且不添加甲酸铵。一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的编码序列为SEQIDNO.2或者SEQIDNO.5的苏氨酸脱氨酶重组的多肽。优选的，所述多核苷酸的序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.4。一种重组质粒，其特征在于，包括表达载体连接序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.4的多核苷酸。一种宿主细胞，其特征在于，其包含如权利要求7的重组质粒。优选的，所述细胞是一种大肠杆菌。通过采用以上技术方案，本专利技术达到的技术效果如下：1、本专利技术公开的技术方案，利用热稳定的苏氨酸脱氨酶，避免使用甲酸铵引入铵离子，利用热稳定的醇脱氢酶循环辅酶再生，优势在于整个体系不引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高温生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，通过热稳定的苏氨酸脱氨酶能将L苏氨酸转化成2-丁酮酸，再通过亮氨酸脱氢酶及醇脱氢酶转化2-丁酮酸生成L-2-氨基丁酸，所述苏氨酸脱氨酶源于Chryseobacterium takakiae的野生型苏氨酸脱氨酶或其突变体，且所述突变体与SEQ ID NO.2具有90％以上相似性并具有以下特征中的一个或多个突变：H63N，I78V，E202S，R375K，所述苏氨酸脱氨酶突变体的序列为SEQ ID NO.5。/n

【技术特征摘要】
1.一种高温生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，通过热稳定的苏氨酸脱氨酶能将L苏氨酸转化成2-丁酮酸，再通过亮氨酸脱氢酶及醇脱氢酶转化2-丁酮酸生成L-2-氨基丁酸，所述苏氨酸脱氨酶源于Chryseobacteriumtakakiae的野生型苏氨酸脱氨酶或其突变体，且所述突变体与SEQIDNO.2具有90％以上相似性并具有以下特征中的一个或多个突变：H63N，I78V，E202S，R375K，所述苏氨酸脱氨酶突变体的序列为SEQIDNO.5。


2.根据权利要求1所述的一种高温生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述苏氨酸脱氨酶或其突变体比大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶具有更高的热稳定性。


3.根据权利要求1所述的一种高温生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，反应温...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁雪峰，钱明，代兴兴，
申请(专利权)人：南京诺云生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32