一种以氨基酸为底物生产亚精胺的方法及工程菌技术

本发明专利技术公开了一种以氨基酸为底物生产亚精胺的方法及工程菌，属于生物工程技术领域。本发明专利技术构建了表达精氨酸脱羧酶、胍基丁胺脲水解酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸‑β‑半醛脱氢酶、羧基亚精胺脱氢酶、羧基亚精胺脱羧酶、葡萄糖脱氢酶、多聚磷酸盐激酶2‑I的重组细胞或者重组细胞的组合，并利用重组细胞或者重组细胞的组合催化天冬氨酸和精氨酸合成亚精胺。本发明专利技术选用的氧化还原酶类均能高效使用NAD(NADH)为辅酶、反应过程无产物反馈抑制，具有良好的工业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种以氨基酸为底物生产亚精胺的方法及工程菌
本专利技术涉及一种以氨基酸为底物生产亚精胺的方法及工程菌，属于生物工程

技术介绍
亚精胺(Spermidine)，线性分子式为NH2(CH2)3NH(CH2)4NH2，广泛存在于微生物、植物和动物体内，是一种重要的生理活性物质。亚精胺具有延长动物寿命的功效，并抵消与年龄相关的疾病，如心血管疾病，神经退行性疾病和癌症等。如图1所示，生物体中主要有两条途径合成亚精胺(1)经由羧基化腺苷甲硫氨酸和腐胺在亚精胺合成酶的作用下直接合成亚精胺，羧基化腺苷甲硫氨酸可由常见的甲硫氨酸(Met)，经过相关酶的腺苷化和脱羧化催化得到，该途径在动物、植物和微生物体内，是比较常见的传统亚精胺合成的途径；(2)经由天冬氨酸-β-半醛和腐胺在羧基亚精胺脱氢酶和脱羧酶的催化下合成亚精胺，天冬氨酸-β-半醛可经常见氨基酸如天冬氨酸(Asp)经相关酶的磷酸化和脱氢化催化合成，该途径为新发现的替代合成途径，主要存在于一些细菌中，包括重要的人类病原体，肠道菌群等。两条途径都涉及到重要的中间体-腐胺(Put)，腐胺可由常见的氨基酸-鸟氨酸(Orn)或精氨酸(Arg)经过相关酶催化合成得到，在亚精胺的合成过程中，是重要的中间底物。由于这些途径中的酶受到高度调控，动植物体的亚精胺含量较低，目前也未发现可以大量生产亚精胺的微生物。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是以氨基酸为底物合成亚精胺，尤其是构建多酶共表达的基因工程菌，利用该基因工程菌以氨基酸为底物合成亚精胺，实现亚精胺的高效生产。[技术方案]本专利技术提供了以氨基酸为底物合成亚精胺的方法，所述氨基酸为天冬氨酸和精氨酸；L-精氨酸被精氨酸脱羧酶(Argininedecarboxylase)脱羧生成胍基丁胺，进一步被胍基丁胺脲水解酶(Agmatineureohydrolase)作用生成腐胺；L-天冬氨酸被天冬氨酸激酶(Aspartokinase)以ATP为辅酶催化生成天冬氨酰-β-磷酸和ADP，天冬氨酰-β-磷酸被天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(aspartate-β-semialdehydedehydrogenase)以NADPH或NADH为辅酶催化生成L-天冬氨酸半醛和NAD(NADP)，羧基亚精胺脱氢酶(Carboxyspermidinedehydrogenase)以NADPH或NADH为辅酶将L-天冬氨酸半醛和腐胺合成为羧基亚精胺，辅酶再生为NAD(NADP)，最后羧基亚精胺脱羧酶(Carboxyspermidinedecarboxylase)将羧基亚精胺脱羧生成亚精胺；在以上过程中由葡萄糖脱氢酶(Glucosedehydrogenase)实现NADH(NADPH)的再生、由多聚磷酸盐激酶2-I(polyphosphatekinase2-I,PPK2-I)实现ATP的再生。在一种实施方式中，所述精氨酸脱羧酶来自于EscherichiacoliBL21(DE3)。或者，所述精氨酸脱羧酶是氨基酸序列是NCBI上accessionNO.为ACT44585.1的序列。或者，编码所述精氨酸脱羧酶的基因的核苷酸序列是NCBI上accessionNO.为CP001509REGION:complement(2914793..2916769)所示的序列。或者，编码所述精氨酸脱羧酶突变体的核苷酸序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示。在一种实施方式中，所述胍基丁胺脲水解酶为来自于EscherichiacoliBL21(DE3)。或者，所述胍基丁胺脲水解酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO.为ACT44584.1的序列。或者，所述胍基丁胺脲水解酶的核苷酸序列是NCBI上accessionNO.为CP001509REGION:complement(2913735..2914655)的序列。在一种实施方式中，所述L-天冬氨酸激酶为来自于ClostridiumsymbiosumATCC14940、Campylobacterjejunisubsp.jejuniATCC700819、BacilluscoagulansDSM1。或者，所述L-天冬氨酸激酶，其氨基酸序列是NCBI上accessionNO.为ERI80757.1、YP_002344012.1、AJH79997.1的序列。或者，L-天冬氨酸激酶的核苷酸序列是NCBI上accessionNO.为AWSU01000003REGION:complement(10218..11426)、NC_002163REGION:541843..543045、CP009709REGION:complement(957019..958248)的序列。在一种实施方式中，所述天冬氨酸-β-半醛脱氢酶为来自于RhodobactersphaeroidesATCCBAA-808、ClostridiumsymbiosumATCC14940、BacilluscoagulansDSM1、PrevotellabiviaDSM20514、LactobacillusfermentumATCC14931，LactobacillusreuteriDSM20016、RuminococcuscallidusATCC27760、BacteroidescellulosilyticusDSM14838。或者，所述天冬氨酸-β-半醛脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accessionNO.为YP_354457.1、ERI74627.1、AJH78885.1、EIM32299.1、EEI21839.1、KRK52213.1、ERJ96894.1、EEF86657.1的序列。或者，天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accessionNO.为NC_007493REGION:3154877..3155899、AWSU01000307REGION:complement(28522..29628)、CP009709REGION:215590..216636、JH660660REGION:605188..606201、ACGI01000096REGION:complement(87687..88739)、AZDD01000002REGION:42759..43835、AWVF01000093REGION:108774..109862、ACCH01000503REGION:1..871的序列。在一种实施方式中，所述羧基亚精胺脱氢酶为来自于BacilluscoagulansDSM1、Clostridiumsp.DSM8431、PrevotellabiviaDSM20514、RuminococcuscallidusATCC27760、Campylobacterjejunisubsp.jejuniATCC700819、PorphyromonascatoniaeATCC51270、RhodobactersphaeroidesATCCBAA-808、Clostridium本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以氨基酸为底物合成亚精胺的方法，其特征在于，所述氨基酸为天冬氨酸和精氨酸；L-精氨酸被精氨酸脱羧酶脱羧生成胍基丁胺，胍基丁胺进一步被胍基丁胺脲水解酶作用生成腐胺；L-天冬氨酸被天冬氨酸激酶以ATP为辅酶催化生成天冬氨酰-β-磷酸和ADP，天冬氨酰-β-磷酸被天冬氨酸-β-半醛脱氢酶以NADPH或NADH为辅酶催化生成L-天冬氨酸半醛和NAD(NADP)，羧基亚精胺脱氢酶以NADPH或NADH为辅酶将L-天冬氨酸半醛和腐胺合成为羧基亚精胺，辅酶再生为NAD(NADP)，最后羧基亚精胺脱羧酶将羧基亚精胺脱羧生成亚精胺；在以上过程中由葡萄糖脱氢酶实现NADH(NADPH)的再生、由多聚磷酸盐激酶2-I实现ATP的再生。/n

【技术特征摘要】
1.一种以氨基酸为底物合成亚精胺的方法，其特征在于，所述氨基酸为天冬氨酸和精氨酸；L-精氨酸被精氨酸脱羧酶脱羧生成胍基丁胺，胍基丁胺进一步被胍基丁胺脲水解酶作用生成腐胺；L-天冬氨酸被天冬氨酸激酶以ATP为辅酶催化生成天冬氨酰-β-磷酸和ADP，天冬氨酰-β-磷酸被天冬氨酸-β-半醛脱氢酶以NADPH或NADH为辅酶催化生成L-天冬氨酸半醛和NAD(NADP)，羧基亚精胺脱氢酶以NADPH或NADH为辅酶将L-天冬氨酸半醛和腐胺合成为羧基亚精胺，辅酶再生为NAD(NADP)，最后羧基亚精胺脱羧酶将羧基亚精胺脱羧生成亚精胺；在以上过程中由葡萄糖脱氢酶实现NADH(NADPH)的再生、由多聚磷酸盐激酶2-I实现ATP的再生。


2.一种能够以氨基酸为底物合成亚精胺的重组细胞或者重组细胞的组合，其特征在于，所述重组细胞表达了精氨酸脱羧酶、胍基丁胺脲水解酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、羧基亚精胺脱氢酶、羧基亚精胺脱羧酶、葡萄糖脱氢酶、多聚磷酸盐激酶2-I；所述重组细胞的组合，含两个或两个以上的重组细胞，每个重组细胞表达8种酶中的一种或以上，重组细胞的组合共同实现上述8种酶的表达。


3.根据权利要求2所述的一种能够以氨基酸为底物合成亚精胺的重组细胞或者重组细胞的组合，其特征在于，所述重组细胞或者重组细胞的组合可以选择大肠杆菌为宿主，包括EscherichiacoliBL21(DE3)。


4.根据权利要求2或3所述的一种能够以氨基酸为底物合成亚精胺的重组细胞或者重组细胞的组合，其特征在于，8种酶可以在宿主中借助载体进行表达融合表达或共表达，或者整合到宿主的基因组...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡宇杰，梁鑫鑫，惠红杰，邓华祥，丁彦蕊，白亚军，郑晓晖，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32