一种多位点miRNA联合检测方法技术

本发明专利技术公开了一种多位点miRNA联合检测方法，包括：1)针对每个目的miRNA序列设计合成一对特异性单链DNA探针，与相对应的待检测miRNA片段进行杂交，形成多个杂化双链；2)使用连接酶将步骤1)形成的杂化双链中的探针连接；3)使用通用引物对步骤2)中产生的连接产物进行扩增；4)使用特异性磁性微珠对步骤3)产物片段进行杂交；5)使用链霉亲和素标记的荧光染料对步骤4)产物进行荧光标记；6)检测步骤5)产物荧光信号并进行数据分析。本发明专利技术的方法无需进行逆转录，节省成本，降低损失；特异性好，可区分单个碱基；可实现多重检测，以及适用于各领域多位点miRNA的定量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种多位点miRNA联合检测方法
本专利技术属于miRNA检测
，涉及一种多位点miRNA联合检测方法。
技术介绍
miRNA已经作为肝癌的血液学分子标志物加入《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》。该规范指出，目前基于循环miRNA模型的肝癌检测试剂盒已经由多家医院验证，并获得国家药物监督管理局三类医疗器械注册证，进入临床应用。此外，在冰冻组织、福尔马林固定组织或石蜡包埋的临床组织样本中，miRNA也都表达出较高的稳定性，更进一步表明其作为诊断性分子标记物具有巨大潜能。但是由于miRNA本身碱基数过少，使得探针碱基序列的选择受限。并且不同miRNA具有不同的最适杂交温度，在相同的杂交条件下，往往会引起很大程度的错配杂交，从而限制了不同miRNA的高效识别。另外，miRNA序列还存在高度相似性，所以检测的特异性往往也难以保证。目前常见的miRNA检测方法分为直接检测和间接检测两个类别。直接检测方法主要基于荧光、比色、电化学等方法，这些方法可以直接检测miRNA的水平和表达，但是灵敏度较低，且难以区分序列相近的同源miRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多位点miRNA联合检测方法，包括以下步骤：/n1)设计并合成5′端带有生物素标记的上游通用引物F和下游通用引物R；针对每个目的miRNA序列设计合成一对特异性单链DNA探针：探针A和探针B，与相对应的待检测miRNA片段进行杂交，形成多个杂化双链；/n探针A：5′端开始依次为：上游通用引物序列——与miRNA的3′端8-14个碱基反向互补序列；/n探针B：5′端开始依次为：磷酸化标记——与miRNA的5′端8-14个碱基反向互补序列——特异性tag序列——下游通用引物反向互补序列；/n2)使用连接酶将步骤1)形成的杂化双链中的探针A和探针B连接；/n3)使用通用引物对步骤2)中产生的...

【技术特征摘要】
1.一种多位点miRNA联合检测方法，包括以下步骤：
1)设计并合成5′端带有生物素标记的上游通用引物F和下游通用引物R；针对每个目的miRNA序列设计合成一对特异性单链DNA探针：探针A和探针B，与相对应的待检测miRNA片段进行杂交，形成多个杂化双链；
探针A：5′端开始依次为：上游通用引物序列——与miRNA的3′端8-14个碱基反向互补序列；
探针B：5′端开始依次为：磷酸化标记——与miRNA的5′端8-14个碱基反向互补序列——特异性tag序列——下游通用引物反向互补序列；
2)使用连接酶将步骤1)形成的杂化双链中的探针A和探针B连接；
3)使用通用引物对步骤2)中产生的连接产物进行扩增；
4)使用特异性磁珠对步骤3)产物片段进行杂交；
5)使用链霉亲和素标记的荧光染料对步骤4)产物进行荧光标记；
6)检测步骤5)产物荧光信号并进行数据分析。


2.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤1)中，进行杂交的条件为：80-90℃，2-5min，缓慢降至室温，保持2-4h。


3.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述连接酶选自T4DNA连接酶或T4RNA连接酶或SplintRDNA连接酶。


4.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤2)中，连接条件为：16-37℃，15-60...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵辉，高蕾，
申请(专利权)人：昂凯生命科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32