一种基于CRISPR技术的基因检测方法及试剂盒与应用技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR技术的基因检测方法，其主要步骤包括：(1)目的基因的引物设计及扩增；(2)sgRNA的设计、转录和纯化；(3)Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物的制备；(4)信号探针的制备；(5)检测载体的制备；(6)样品的检测与结果读取。本发明专利技术还包括两种基于所述检测方法的试剂盒及其应用。本发明专利技术可以实现精准的基因检测，结果稳定，并且杂交探针通用，操作简单，特异性极高，方便推广。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR技术的基因检测方法及试剂盒与应用
本专利技术涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种基于CRISPR技术的基因检测方法及试剂盒与应用。
技术介绍
近年来用于基因检测的核酸试纸条得到不断发展，为实现定点简便的核酸检测提供了一种很有前景的方法。它的原理是基于三明治氏核酸杂交反应，结合金纳米粒子或者其他纳米颗粒以及酶联免疫法等在侧向流动试纸条上实现比色检测。已报道的方法中结合核酸扩增方法如非对称PCR扩增以及其他恒温扩增方法，以得到一种单链DNA或RNA产物，与预先设计好包埋在试纸条上的T线和C线探针特异性杂交并且利用底物显色而达到检测效果。然而，这种方法不具有广普性，针对不同的检测物需要设计不同的特异性杂交探针，而且扩增设计相对复杂，易出现假阳性且特异性不强的问题。CRISPR技术是近年来发展的一种基因组工程学工具，该工具已经彻底革新了生命科学领域，在生物医学、农业等领域具有极大的应用前景。它的强大之处在于它能够对基因进行指定位置的精确编辑。具体来说，在Cas蛋白和向导RNA的共同作用下，细胞基因组DNA或其他外源DNA可以被精确剪切。被CRISPR/Cas系统剪切需要满足以下几个条件。首先，被编辑的基因区域需要存在相对保守的PAM序列(前间隔序列邻近基序)。其次，向导RNA要和PAM上游的序列碱基(一般20个碱基左右)互补配对。Cas蛋白在和向导RNA结合后，会搜寻基因序列，当识别到指定的序列，便可以靶向上去进行特定位点切割。通过对这种向导RNA的设计以及对PAM位点的甄别，可以实现单碱基分辨率的基因检测。并且，整个过程只需要在恒温37℃条件下反应15-30min即可。但是目前利用CRISPR技术来进行基因检测的方法大都利用荧光定量的方法来实现，这种方法依赖昂贵的仪器来实现，不适用于资源有限的地区使用。近期研究发现，DNA在被Cas9蛋白剪切后，只会在特定位点断开，但并不会从Cas9-sgRNA结构中脱离。类似的还有dCas9蛋白，它虽然没有切割DNA的能力，但仍能够在sgRNA的引导下与特定DNA序列结合。对于Cas12a蛋白，在将目标DNA区域剪切完之后，PAM远端的DNA片段脱离，而PAM近端的DNA片段仍然结合在蛋白-crRNA复合结构中。本专利技术基于此设计了一种结合CRISPR技术的核酸纸芯片基因检测技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述现有技术的缺点和不足，提供一种基于CRISPR技术的基因检测方法及其试剂盒与应用。本专利技术是通过以下技术方案来实现的：一种基于CRISPR技术的基因检测方法，具体包括以下步骤：(1)目的基因的引物设计及扩增。根据目的基因设计两条引物，其中一条引物的一端修饰有功能基团，然后以待测样品的基因组DNA或RNA为模板进行扩增。所述的功能基团可以为生物素等。所述的扩增方法可以为PCR、RPA或LAMP等方法。(2)sgRNA的设计、转录和纯化。首先设计sgRNA体外转录所需DNA模板的PCR扩增引物，其中上游引物包含有T7启动子区和20-nt的与靶DNA相关序列等，下游引物主要用于编码sgRNA的3’末端序列；然后通过PCR扩增得到sgRNA转录模板DNA，经PCR产物纯化试剂盒纯化后用于T7RNA聚合酶介导的转录反应，从而体外转录出sgRNA。得到的sgRNA产物用RNA纯化试剂盒纯化，纯化后的sgRNA冻存在-80℃以备使用。(3)Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物的制备。所述Cas蛋白为Cas9蛋白、dCas9蛋白或Cas12蛋白，所述sgRNA由步骤(2)得到，所述靶标为步骤(1)得到的修饰有功能基团的扩增产物。DNA在被Cas9蛋白剪切后，只会在特定位点断开，但并不会从Cas9-sgRNA结构中脱离。dCas9蛋白虽然没有切割DNA的能力，但仍能够在sgRNA的引导下与特定DNA序列结合。Cas12a蛋白在将目标DNA区域剪切完之后，PAM远端的DNA片段脱离，而PAM近端的DNA片段仍然结合在蛋白-crRNA复合结构中。因此，Cas9蛋白、dCas9蛋白或Cas12蛋白可以与Cas蛋白/sgRNA形成复合物。先将Cas蛋白和sgRNA以一定的浓度比在反应缓冲液中于室温下混合静止孵育一段时间，形成Cas蛋白/sgRNA复合体；然后将该复合体与步骤(1)中扩增得到的带有功能基团的靶标相互作用，反应条件为37℃孵育一段时间，由此得到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物。(4)信号探针的制备。所述信号探针为可以被探测信号的分子标记物、酶或者纳米颗粒；所述信号探针能够与步骤(3)所述Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物结合。分子标记物可以为：荧光探针、吸收探针、化学发光探针、生物发光探针等。酶的种类可以为：辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、纳米酶等其他具有催化活性的酶。纳米颗粒可以为纳米金、纳米棒、量子点、石墨烯、上转换纳米粒子、氧化铁等有机和无机纳米粒子。(5)检测载体的制备。所述检测载体为侧向流或垂直流，且检测载体的检测线或点上包被有能够与步骤(1)所述功能基团牢固结合的物质。(6)样品的检测与结果读取。将步骤(3)所述的Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物通过检测载体进行检测，如果检测线或点检测到所述信号探针相应的信号，则待测样品中含有目的基因，否则待测样品中不含目的基因。进一步地，步骤(4)所述的信号探针与第一特定DNA序列共价或非共价结合从而得到被标记的DNA-信号探针，所述第一特定DNA序列与步骤(1)所述的扩增产物存在部分互补序列，使所述DNA-信号探针能够与Cas/sgRNA复合物识别解旋的扩增产物的非靶向链杂交结合，从而使信号探针能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。或者，步骤(4)所述的信号探针可以与步骤(2)所述的sgRNA发生共价或非共价偶联，从而使其能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。共价偶联可以通过在sgRNA的端头修饰巯基、氨基、羧基、羟基、醛基等活性基团与信号探针共价连接。非共价偶联可以通过在sgRNA的端头修饰poly(A)或者poly(C)等与信号探针如金纳米颗粒具有亲和作用的碱基发生偶联反应。或者，步骤(2)所述sgRNA的茎环结构的环区域添加有一段序列，步骤(4)所述的信号探针与第二特定DNA序列共价或非共价结合从而得到被标记的DNA-信号探针，所述第二特定DNA序列与所述sgRNA的添加序列存在部分互补序列，使所述DNA-信号探针能够与sgRNA结合，从而使信号探针能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。此处的共价偶联可以通过在特定DNA序列的端头修饰巯基、氨基、羧基、羟基、醛基等活性基团与信号探针共价连接。非共价偶联可以通过在特定DNA序列的端头修饰poly(A)或者poly(C)等与信号探针如金纳米颗粒具有亲和作用的碱基发生偶联反应。或者，步骤(4)所述的信号探针可以与步骤(3)所述的Cas蛋白共价或者非共价偶联，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR技术的基因检测方法，具体包括以下步骤：/n(1)目的基因的引物设计及扩增；根据目的基因设计两条引物，其中一条引物的一端修饰有功能基团，然后以待测样品的基因组DNA或RNA为模板进行扩增；/n(2)sgRNA的设计、转录和纯化；/n(3)Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物的制备；所述Cas蛋白为Cas9蛋白、dCas9蛋白或Cas12蛋白，所述sgRNA由步骤(2)得到，所述靶标为步骤(1)得到的修饰有功能基团的扩增产物；/n(4)信号探针的制备；所述信号探针为可以被探测到信号的分子标记物、酶或者纳米颗粒，所述信号探针能够与步骤(3)所述Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物结合；/n(5)检测载体的制备；所述检测载体为侧向流或垂直流载体，且检测载体的检测线或点上包被有能够与步骤(1)所述功能基团牢固结合的物质；/n(6)样品的检测与结果读取；将步骤(3)所述的Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物通过步骤(5)所述检测载体进行检测，如果检测线或点检测到所述信号探针相应的信号，则待测样品中含有目的基因，否则待测样品中不含目的基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR技术的基因检测方法，具体包括以下步骤：
(1)目的基因的引物设计及扩增；根据目的基因设计两条引物，其中一条引物的一端修饰有功能基团，然后以待测样品的基因组DNA或RNA为模板进行扩增；
(2)sgRNA的设计、转录和纯化；
(3)Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物的制备；所述Cas蛋白为Cas9蛋白、dCas9蛋白或Cas12蛋白，所述sgRNA由步骤(2)得到，所述靶标为步骤(1)得到的修饰有功能基团的扩增产物；
(4)信号探针的制备；所述信号探针为可以被探测到信号的分子标记物、酶或者纳米颗粒，所述信号探针能够与步骤(3)所述Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物结合；
(5)检测载体的制备；所述检测载体为侧向流或垂直流载体，且检测载体的检测线或点上包被有能够与步骤(1)所述功能基团牢固结合的物质；
(6)样品的检测与结果读取；将步骤(3)所述的Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物通过步骤(5)所述检测载体进行检测，如果检测线或点检测到所述信号探针相应的信号，则待测样品中含有目的基因，否则待测样品中不含目的基因。


2.根据权利要求1所述的基于CRISPR技术的基因检测方法，其特征在于，步骤(4)所述的信号探针与第一特定DNA序列共价或非共价结合从而得到被标记的DNA-信号探针，所述第一特定DNA序列与步骤(1)所述的扩增产物存在部分互补序列，使所述DNA-信号探针能够与Cas/sgRNA复合物识别解旋的扩增产物的非靶向链杂交结合，从而使信号探针能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。


3.根据权利要求1所述的基于CRISPR技术的基因检测方法，其特征在于，步骤(4)所述的信号探针可以与步骤(2)所述的sgRNA发生共价或非共价偶联，从而使其能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。


4.根据权利要求1所述的基于CRISPR技术的基因检测方法，其特征在于，步骤(2)所述sgRNA的茎环结构的环区域添加有一段序列，步骤(4)所述的信号探针与第二特定DNA序列共价或非共价结合从而得到被标记的DNA-信号探针，所述第二特定DNA序列与所述sgRNA茎环结构处的添加序列存在部分互补序列，使所述DNA-信号探针能够与sgRNA结合，从而使信号探针能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。


5.根据权利要求1所述的基于CRISPR技术的基因检测方法，其特征在于，步骤(4)所述的信号探针可以与步骤(3)所述的Cas蛋白共价或者非共价偶联，从而使其能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。


6.根据权利要求1所述的基于CRISPR技术的基因检测方法，其特征在于，步骤(5)所述侧向流检测载体为试纸条，所述试纸条由底板样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板组...

【专利技术属性】
技术研发人员：周小明，王徐升，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44