基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，包括如下步骤：(1)制备30纳米直径的银纳米颗粒悬浊液；(2)将巯基化的DNA探针加入到步骤(1)中制备的悬浊液中；(3)将待测DNA样品加入到步骤(2)中铆定了DNA探针的银纳米颗粒悬浊液中；(4)向步骤(3)中得到的悬浊液中加入硫酸镁溶液，呈负电的银纳米颗粒及DNA探针将在二价镁离子的桥接作用下团簇，形成三明治团簇结构，最后，将装有三明治团簇结构的离心管固定到玻璃管支撑上，进行拉曼光谱测量。本发明专利技术既保证DNA测量过程中对DNA试验品的无损检测，又实现DNA杂化信号的可靠区分，测量精度高，速度快，成本低。

【技术实现步骤摘要】
基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法
本专利技术属于DNA检测的光学装置
，尤其涉及一种基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法。
技术介绍
DNA和蛋白质的检测对于遗传病的诊断和治疗，以及传染源检测、药物发现等至关重要，而这类生物检测通常依赖于DNA杂交或抗原抗体的相互作用，超灵敏检测技术实现DNA杂交或抗原抗体相互作用的直接有效检测有很重要的意义。电化学传感器由于其自身超高的灵敏度，固有的简单性和小型化，低成本和低功耗受到学者的广泛关注和研究。电化学传感器检测手段的主要原理是首先将一个与待测DNA碱基互补配对的DNA识别探针铆定到信号传感器上，当待测DNA与DNA识别探针碱基互补配对以后，信号传感器产生配对信号，实现DNA碱基互补配对事件的检测。将铆定有DNA识别探针的识别表面暴露在含有待检测DNA单链的样本中，是实现高效率，高准确度探测DNA碱基互补配对事件的前提。通过表面修饰巯基己醇，探针DNA上碱基吸附可以很好的被排斥，使得探针DNA可以很好的暴露出来。早期的DNA杂化检测传感器使用氧化还原指示符区分电极上的单链和双链DNA，Mikkelsen等人利用等人利用Co(phen)33+作为氧化还原指示符，其中Co(phen)33+与双链DNA有很好的亲和性，当碱基发生碱基互补配对形成双链时，产生电化学响应。Ozsoz等人利用亚甲蓝作为氧化还原指示符因为亚甲蓝对暴露的鸟嘌呤碱基有很好亲和力。DNA杂化传感的另一种方法是利用双链DNA自身在长距离内充当电子传递的管道的能力，且电子传递速率随距离的减小很小而单链DNA的电子传输效率很低。采用电化学传感检测DNA杂化已经得到很多的研究和发展，但是由于电化学反应本身的复杂性和低可控性，特别是电极材料及氧化还原指示剂的选择使得电化学传感技术的进一步发展受到阻碍。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术公开了一种基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，该方法一方面利用非接触式光学检测技术提高检测可靠性，另一方面利用近场光学增强效果显著提高单位点光谱的强度和灵敏度，实现DNA杂化光谱信号的直接检测。为达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，该方法包括如下步骤：(1)制备30纳米直径的银纳米颗粒悬浊液；(2)按体积比1:100将10-4摩尔每升巯基化的DNA探针加入到步骤(1)中制备的银纳米颗粒悬浊液中，然后将其进行离心水洗后重新分散于超纯水中使其成为铆定了DNA探针的银纳米颗粒悬浊液；(3)将待测DNA样品加入到步骤(2)中铆定了DNA探针的银纳米颗粒悬浊液中，加入的体积等于10-4摩尔每升巯基化的DNA探针的体积，充分混合，混合后的悬浊液水浴缓慢加热到95摄氏度，并保温10分钟，然后逐渐冷却到室温；(4)向步骤(3)中得到的悬浊液中加入1毫摩尔每升的硫酸镁溶液，加入的体积等于10-4摩尔每升巯基化的DNA探针的体积，呈负电的银纳米颗粒及DNA探针将在二价镁离子的桥接作用下团簇，形成三明治团簇结构，最后，将装有三明治团簇结构的离心管固定到玻璃管支撑上，进行拉曼光谱测量。所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，所述30纳米银纳米颗粒采用化学方法合成，具体包括以下步骤：首先，将溶剂水与丙三醇按照质量比为6:5的比例混合搅拌均匀，加热到95摄氏度时加入质量为溶剂水质量0.003％的硝酸银保温一分钟，然后加入质量为硝酸银质量的0.33％的柠檬酸钠，通过冷凝回流装置防止溶剂水蒸发，持续保温在95℃，搅拌一小时，冷却到室温，便得到30纳米直径的银纳米颗粒悬浊液。所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，采用化学方法合成的30纳米银纳米颗粒采用柠檬酸钠还原，具体方法是：将制备好的30纳米银纳米颗粒悬浊液经12000转每秒高速离心水洗后分散于溶剂水中，柠檬酸根吸附在银纳米颗粒上，无法被离心水洗清除，再分散后的30纳米银纳米颗粒表面功能团为带负电的柠檬酸根。所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，步骤(2)中所述铆定了DNA探针的银纳米颗粒悬浊液；具体方法是：按体积比1:100将10-4摩尔每升巯基化的DNA探针加入到步骤(1)中制备的银纳米颗粒悬浊液中，静置反应30分钟后用超纯水离心洗涤三次，去除悬浊液中残留的未吸附的巯基化探针DNA，获得表面铆定巯基化探针DNA的30纳米银纳米颗粒悬浊液。所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，步骤(3)中得到的悬浊液还包括，用超纯水离心洗涤三次，去除悬浊液中残留的未杂化的待测DNA样品得到杂化后的DNA样品的步骤。所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，步骤(4)中所述拉曼光谱测量的具体方法是：通过聚焦镜实现激光入射，使入射激光光束照射到DNA与纳米颗粒自组装样品上，激光激发团簇后30纳米银纳米颗粒产生局域表面等离子体发生共振耦合，使得团簇后30纳米银纳米颗粒间形成的纳米间隙内的局域电磁场增强到108-1012数量级，通过采集激光入射点的表面增强拉曼光谱，并与未发生DNA杂化的光谱作对比获取测量位点处拉曼光谱的产生来源，从而确定该测量位点处的是否发生DNA杂化。有益效果：1.本专利技术采用非接触式光学测量技术，耦合近场光学增强技术与拉曼光谱技术实现超灵敏DNA分子化学结构信息的测量，即表面增强拉曼测量技术；既保证DNA测量过程中对DNA试验品的无损检测，又实现DNA杂化信号的可靠区分，测量精度高，速度快，成本低。2.表面修饰有探针DNA的纳米颗粒悬浊液的制备是实现DNA杂化检测的关键技术之一。由于巯基与银之间可以形成很强的化学键，这样便获得表面修饰有探针DNA的纳米颗粒悬浊液。由于银纳米颗粒带负电，排斥带负电的碱基，保证DNA可以很好的暴露在溶液中，方便进行碱基互补配对。3.DNA与纳米颗粒自组装是实现DNA杂化检测的另一个关键技术。所述DNA与纳米颗粒自组装样品通过团簇剂二价镁离子诱导。由于DNA本身呈电负性，纳米颗粒也呈电负性，带正电二价镁离子起到桥接作用，促进DNA与纳米颗粒团簇形成三明治结构。团簇后纳米颗粒的之间的间隙在1-3纳米，当激光入射时，会产生局域表面等离子体共振，使得纳米间隙内局域电磁场得到显著增强到108-1012数量级，而处在此纳米间隙内的DNA分子的拉曼光谱信号作为一种电磁波，强度会得到极大的增强，使得DNA分子的拉曼光谱信号获取成为可能。4.杂化后双链DNA与未杂化单链DNA信号可靠识别与区分是实现DNA杂化检测的最关键技术之一。拉曼光谱作为一种分子指纹光谱随着分子结构变化而变化，巯基化DNA与未巯基化DNA拉曼信号显著不同，巯基化DNA信号中腺嘌呤的信号显著强于DNA中另外三种碱基的信号，且巯基化对其他碱基的相对信号强度影响很小，基于此，可以通过表面增强拉曼光谱确认巯基化DNA是否铆定到银纳米颗粒表面，另外，DNA中主要包含四种碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：/n(1)制备30纳米直径的银纳米颗粒悬浊液；/n(2)按体积比1:100将10

【技术特征摘要】
1.一种基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)制备30纳米直径的银纳米颗粒悬浊液；
(2)按体积比1:100将10-4摩尔每升巯基化的DNA探针加入到步骤(1)中制备的银纳米颗粒悬浊液中，然后将其进行离心水洗后重新分散于超纯水中使其成为铆定了DNA探针的银纳米颗粒悬浊液；
(3)将待测DNA样品加入到步骤(2)中铆定了DNA探针的银纳米颗粒悬浊液中，加入的体积等于10-4摩尔每升巯基化的DNA探针的体积，充分混合，混合后的悬浊液水浴缓慢加热到95摄氏度，并保温10分钟，然后逐渐冷却到室温；
(4)向步骤(3)中得到的悬浊液中加入1毫摩尔每升的硫酸镁溶液，加入的体积等于10-4摩尔每升巯基化的DNA探针的体积，呈负电的银纳米颗粒及DNA探针将在二价镁离子的桥接作用下团簇，形成三明治团簇结构，最后，将装有三明治团簇结构的离心管固定到玻璃管支撑上，进行拉曼光谱测量。


2.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，其特征在于：所述30纳米银纳米颗粒采用化学方法合成，具体包括以下步骤：首先，将溶剂水与丙三醇按照质量比为6:5的比例混合搅拌均匀，加热到95摄氏度时加入质量为溶剂水质量0.003％的硝酸银保温一分钟，然后加入质量为硝酸银质量的0.33％的柠檬酸钠，通过冷凝回流装置防止溶剂水蒸发，持续保温在95℃，搅拌一小时，冷却到室温，便得到30纳米直径的银纳米颗粒悬浊液。


3.根据权利要求2所述的基于表面增强拉曼散射光谱技术的DNA杂化检测方法，其特征在于：采用化学方法合成的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈云飞，王永康，张艳，魏志勇，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32