一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR‑Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法：以生物样品中特异性核酸片段为研究对象，制备生物样品的核酸靶标、猝灭荧光探针、Cas12g三元复合体；将Cas12g三元复合体、核酸靶标、猝灭荧光探针、背景RNA和RNA酶抑制剂混合在核酸酶缓冲液中孵育，当Cas12g三元复合体与核酸靶标识别匹配后，不仅剪切核酸靶标，且附带非特异性反式剪切猝灭荧光探针，进而获取可被检测的荧光；通过采集荧光光谱数据，构建上转换纳米荧光强度变化值与不同浓度的核酸靶标的定量检测模型，实现生物样品中核酸靶标的纳米荧光痕量快速检测。本发明专利技术能够适用于生物样品中特异性核酸片段快速、特异、灵敏的检测方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法
本专利技术属于核酸检测
，尤其是一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法。
技术介绍
伴随着核酸检测技术的快速发展，各种生物样品的快速检测方法相继出现。如致使食源性疾病的食源性致病菌，已成为世界食品安全的热点问题。近年来，国内外的生物恐怖主义威胁以及食源性疾病事件引发人们对食源性致病菌的高度关注。对生物样品中食源性致病菌特异性核酸片段的快速检测是预防食源性疾病的重要手段。目前，核酸检测技术包括基于PCR的检测技术(普通PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR和实时定量反转录PCR等)和非PCR核酸检测技术(环介导等温扩增、核酸依赖性扩增检测技术、基因芯片和微流体芯片等)。这些检测方法虽各有优势，但存在检测周期长或检测费用高或易出现假阳性和假阴性结果等缺陷。因此，迫切需要一种快速、特异、灵敏的适用于生物样品中特异性核酸片段的检测方法。国内外尚未有采用CRISPR-Cas12g系统实现生物样品中特异性核酸片段的纳米荧光定量检测方面的报道。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提出了一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，能够适用于生物样品中特异性核酸片段快速、特异、灵敏的检测方法。本专利技术所采用的技术方案如下：一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法：以生物样品中特异性核酸片段为研究对象，制备生物样品的核酸靶标、猝灭荧光探针、Cas12g三元复合体；将Cas12g三元复合体、核酸靶标、猝灭荧光探针、背景RNA和RNA酶抑制剂混合在核酸酶缓冲液中孵育，当Cas12g三元复合体与核酸靶标识别匹配后，不仅剪切核酸靶标，且附带非特异性反式剪切猝灭荧光探针，进而获取可被检测的荧光；通过采集荧光光谱数据，构建上转换纳米荧光强度变化值与不同浓度的核酸靶标(生物样品特异性核酸片段)的定量检测模型，实现生物样品中核酸靶标(特异性核酸片段)的纳米荧光痕量快速检测。进一步，所述核酸靶标的制备方法为：若生物样品为DNA则提取方法为：经过RPA扩增和体外转录可获得靶标；若生物样品为RNA则提取方法为：经过RT-RPA扩增和体外转录进而得到靶标；进一步，所述猝灭荧光探针的荧光基团采用上转换纳米颗粒(UCNPS)，猝灭基团使用水溶性非荧光猝灭剂QC-1，该淬灭剂能够将一定距离内荧光基团发出的光吸收，拥有较宽的吸收光谱范围(～500nm到～900nm),猝灭效率高(>97％)；所述荧光基团和猝灭基团之间用单链DNA或RNA连接，最终得到猝灭荧光探针QC-1-RNA/DNA-UCNPS。所述猝灭荧光探针拥有信号报告功能，当猝灭荧光探针中的单链RNA或单链DNA被激活的Cas12g蛋白附带切割时，其中的UCNPS发出可被检测的荧光。且上转换纳米颗粒(UCNPS)的光化学性质稳定、基本不受外界环境影响、检测背景低、装置简单以及成本低。进一步，所述上转换纳米颗粒采用高温热分解法合成，过程为：以稀土结晶水合物氯化盐等为原料，油酸和1-十八烯为溶剂，搭建基于稀土元素掺杂的高温热分解法UCNPs合成平台，制备出粒径大小约为50nm的油相OA-UCNPs，在其表面修饰氨基转为水溶性的NH2-UCNPs。进一步，所述Cas12g三元复合体包括Cas12g、crRNA和tracrRNA，所述crRNA和tracrRNA可进行共折叠，crRNA的N区域为可变间隔序列区，且可变间隔序列区与核酸靶标序列互补；进一步，所述Cas12g的制备方法：S1，构建Cas12g蛋白表达质粒。合成Cas12g基因，在Cas12g基因序列两端分别加上BamHI和XhoI酶切位点；用BamHI和XhoI双酶切处理pET28a质粒；将加上BamHI和XhoI酶切位点的Cas12g连接到酶切后的pET28a质粒上，得到Cas12g蛋白表达质粒，即pET28a-Cas12g；S2，将Cas12g蛋白表达质粒转化至感受态细胞，涂平板培养过夜，挑选单菌落扩大培养，待菌液OD600为1～1.5时，用0.2mMIPTG诱导蛋白表达，培养过夜后离心收集培养物，裂解缓冲液+蛋白酶抑制剂进行重悬；超声破碎细胞，4℃条件下28000xg离心20min，将上清液加到HisTrapFF柱上，通过FPLC经咪唑梯度(50mM～500mM)纯化；SDS-PAGE凝胶电泳后再浓缩，透析获得Cas12g蛋白。新型核糖核酸酶Cas12g尺寸小(720-830aa)，且与目标RNA序列识别匹配后不仅能剪切目标RNA，还附带非特异性反式剪切单链DNA或RNA的能力。本专利技术的有益效果：1、本专利技术所提出的一种基于CRISPR-Cas12g的适用于生物样品中特异性核酸片段的纳米荧光痕量快速检测方法，将CRISPR-Cas12g系统、等温扩增技术以及纳米荧光粒子和高效猝灭剂相结合，采用上转换发光纳米技术检测新思路，实现生物样品中特异性核酸片段的定量检测。该方法具有操作简单、成本低、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优势。2、本专利技术通过引入RPA/RT-RPA核酸扩增技术，不仅提高了生物样品中特异性核酸片段检测的灵敏度，而且将应用范围拓展到DNA和RNA均可检测的程度，还具备检测速度快，特异性强，可低温运行，宽松的样本容，多重，低成本，灵活的试剂形态等优势。3、本专利技术涉及的新型猝灭荧光探针，其荧光基团使用光化学性质稳定、基本不受外界环境影响、检测背景低、装置简单以及成本低的上转换纳米粒子(UCNPS)。该荧光基团采用高温热分解法合成，并具备粒径小、单分散、荧光强、稳定性好等特点。猝灭基团使用拥有宽的猝灭范围(～500nm到～900nm),猝灭效率>97％的新型水溶性非荧光猝灭剂QC-1。由于荧光基团的荧光光谱与淬灭基团的吸收光谱相重叠，故猝灭基团可将荧光基团淬灭。荧光基团和猝灭基团之间用DNA或RNA短链连接。该探针具有合成简单、用时短、成本低等优势。4、本专利技术设计的crRNA和tracrRNA通过化学合成法合成，制备简单。crRNA：5’-UUUACCGGCUCUGACACC-间隔序列-3’,间隔序列依据目标RNA设计，其与目标RNA序列互补。tracrRNA序列已知，可直接快速合成。附图说明图1为基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测原理图；图2中，2A为质粒pET28a-Cas12g1图谱；2B为纯化Cas12g1蛋白的SDS-PAGE图；图3为成熟crRNA和tracrRNA共折叠示意图(crRNA的N区域为可变间隔序列区，设计的间隔序列应与目标RNA序列互补)；图4为0.01mg/mL上转换纳米颗粒的荧光光谱图和透射电镜图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，以生物样品中特异性核酸片段为研究对象，制备生物样品的核酸靶标、猝灭荧光探针、Cas12g三元复合体；将Cas12g三元复合体、核酸靶标、猝灭荧光探针、背景RNA和RNA酶抑制剂混合在核酸酶缓冲液中孵育，当Cas12g三元复合体与核酸靶标识别匹配后，不仅剪切核酸靶标，且附带非特异性反式剪切猝灭荧光探针，进而获取可被检测的荧光；通过采集荧光光谱数据，构建上转换纳米荧光强度变化值与不同浓度的核酸靶标的定量检测模型，实现生物样品中核酸靶标的纳米荧光痕量快速检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，以生物样品中特异性核酸片段为研究对象，制备生物样品的核酸靶标、猝灭荧光探针、Cas12g三元复合体；将Cas12g三元复合体、核酸靶标、猝灭荧光探针、背景RNA和RNA酶抑制剂混合在核酸酶缓冲液中孵育，当Cas12g三元复合体与核酸靶标识别匹配后，不仅剪切核酸靶标，且附带非特异性反式剪切猝灭荧光探针，进而获取可被检测的荧光；通过采集荧光光谱数据，构建上转换纳米荧光强度变化值与不同浓度的核酸靶标的定量检测模型，实现生物样品中核酸靶标的纳米荧光痕量快速检测。


2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，所述核酸靶标的制备方法为：若生物样品为DNA则提取方法为：经过RPA扩增和体外转录可获得靶标；若生物样品为RNA则提取方法为：经过RT-RPA扩增和体外转录进而得到靶标。


3.根据权利要求1或2所述的一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，所述猝灭荧光探针的荧光基团采用上转换纳米颗粒UCNPS，猝灭基团使用非荧光猝灭剂QC-1，所述荧光基团和猝灭基团之间用单链DNA或RNA连接，最终得到猝灭荧光探针QC-1-RNA/DNA-UCNPS。


4.根据权利要求3所述的一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，所述上转换纳米颗粒采用高温热分解法合成，过程为：以稀土结晶水合物氯化盐等为原料...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈全胜，刘蕊，吕鹏，李欢欢，黄栋，贺培欢，张运莲，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32