用于检测piRNA与mRNA结合的可视化方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种用于检测piRNA与mRNA结合的可视化方法及其应用，涉及分子生物学技术领域。该方法包括(a)提供单链RNA探针，探针包括piRNA探针和mRNA探针；(b)配置第一反应体系、第二反应体系和第三反应体系；第一反应体系中探针为标记的piRNA探针；第二反应体系中探针为标记的mRNA探针；第三反应体系中探针为标记的piRNA探针和标记的mRNA探针；(c)各反应体系进行结合反应经电泳后观察条带，若第三反应体系出现相比于第一反应体系和第二反应体系滞后的条带，则待检测的piRNA与mRNA结合。该方法具有操作简便、时间短、灵敏度高和可视化等优点。

【技术实现步骤摘要】
用于检测piRNA与mRNA结合的可视化方法及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其是涉及一种用于检测piRNA与mRNA结合的可视化方法及其应用。
技术介绍
piRNA(Piwi-interactingRNA)是从哺乳动物生殖细胞中分离得到的一类长度约为27-32nt的小RNA，并且这种小RNA与PIWI蛋白家族成员相结合才能发挥它的调控作用。目前，越来越多的文献表明piRNA在细胞的生长发育中可以调控mRNA的稳定性、蛋白质的合成、染色质组织和基因组的结构。研究表明，piRNA主要存在于哺乳动物的生殖细胞和干细胞中，通过与PIWI亚家族蛋白结合形成piRNA沉默复合物(piRNA-inducedsilencingcomplex,piRISC)来调控基因沉默途径。近几年来，piRNA在体细胞中的功能也逐渐有文献报道。piRNA的发现为piRNA的研究开辟了一个新领域，被Science评为2006年十大科技进展之一。因此，piRNA的研究不仅可以丰富小分子RNA的研究内容，同时，也有利于进一步了解生物配子发生的分子调控及其机理，具有十分重要的理论价值和应用前景。目前研究piRNA调控基因沉默的功能主要使用的是双荧光素酶报告基因实验，其方法是通过构建piRNA调控mRNA结合区域的双荧光素酶报告基因载体，与piRNA模拟物共转染进入细胞，36-72小时后，裂解细胞取细胞上清液检测荧光素酶的表达情况来判断piRNA与mRNA的结合。荧光素酶报告基因实验操作繁琐，耗时长，所需试剂种类多成本高。因此，改进检测piRNA与mRNA是否能够结合的方法是必要的。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测piRNA与mRNA结合的可视化方法，该方法具有操作简便、时间短、灵敏度高和可视化等优点。为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种用于检测piRNA与mRNA结合的可视化方法，包括：(a)提供探针，所述探针为单链RNA，所述探针包括piRNA探针和mRNA探针；所述piRNA探针的核苷酸序列为待检测的piRNA的核苷酸序列；所述mRNA探针的核苷酸序列为所述待检测的piRNA和mRNA的预测的结合区域的核苷酸序列；(b)配置反应体系，所述反应体系包括第一反应体系、第二反应体系和第三反应体系；所述第一反应体系中探针为标记的所述piRNA探针；所述第二反应体系中探针为标记的所述mRNA探针；所述第三反应体系中探针为标记的所述piRNA探针和标记的所述mRNA探针；(c)各反应体系进行结合反应，反应后各体系的反应产物经电泳后观察条带，若第三反应体系出现相比于第一反应体系和第二反应体系滞后的条带，则所述待检测的piRNA与mRNA结合。优选地，所述探针还包括阴性对照探针，所述阴性对照探针与所述piRNA探针和所述mRNA探针均不结合；所述反应体系还包括第四反应体系；所述第四反应体系中探针为标记的所述piRNA探针、标记的所述mRNA探针和未标记的阴性对照探针；未标记的阴性对照探针的摩尔浓度为标记的所述mRNA探针的20～100倍；若第四反应体系出现和第三反应体系相同的滞后的条带，则所述待检测的piRNA与mRNA结合；优选地，未标记的阴性对照探针的摩尔浓度为标记的所述mRNA探针的40～60倍，优选为50倍。优选地，所述反应体系还包括第五反应体系，所述第五反应体系中探针为标记的所述piRNA探针、标记的所述mRNA探针和未标记的所述piRNA探针，未标记的所述piRNA探针的摩尔浓度为标记的所述mRNA探针的20～100倍；若第五反应体系无游离的标记的所述mRNA探针条带，则所述待检测的piRNA与mRNA结合；优选地，未标记的所述piRNA探针的摩尔浓度为标记的所述mRNA探针的40～60倍，优选为50倍。优选地，所述检测piRNA与mRNA结合包括检测has-piR-016659与HNF1A结合；和/或，检测has-piR-020391与ZNF10结合。优选地，当所述反应体系中同时含有标记的所述piRNA探针和标记的所述mRNA探针时，标记的所述piRNA探针和标记的所述mRNA探针的摩尔比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)，优选为1:1。优选地，所述标记包括荧光染料标记；优选地，荧光染料的发射波长为650～850nm；优选地，用于标记所述piRNA探针的荧光染料和用于标记所述mRNA探针的荧光染料发射波长不相同；优选地，发射波长为650～850nm荧光染料包括IRDye800、Cy5、Cy5.5、Thiadicarbocyanine、IRDye680LT、Alexa750、Alexa660、Alexa647、Dy750、WellREDD2Dye、WellREDD3Dye和WellREDD4Dye中的一种或多种；优选地，标记piRNA探针的荧光染料包括IRDye荧光染料，优选包括IRDye800荧光染料；优选地，标记mRNA探针的荧光染料包括Cy荧光染料，优选包括cy5.5荧光染料；优选地，所述荧光染料标记于探针的5’端或3’端。优选地，所述反应体系包括DEPC-H2O、Bindingbuffer和探针；优选地，反应体系中带有标记的探针浓度为30～50nM，优选为40nM；优选地，所述Bindingbuffer包含如下组分：pH为7.2-7.4的HEPESBuffer、甘油、KCl和MgCl2；优选地，所述Bindingbuffer中各组分在反应体系中的终浓度为：pH为7.2-7.4的HEPESBuffer8～12mM、甘油4～6％(w/w)、KCl0.15～0.25M和MgCl20.5～0.15M；优选地，所述Bindingbuffer中各组分在反应体系中的终浓度为：pH为7.2-7.4的HEPESBuffer10mM、甘油5％(w/w)、KCl0.2M和MgCl20.1M。优选地，先将探针使用DEPC-H2O稀释，再添加至反应体系中；优选地，将探针使用DEPC-H2O稀释后，于94-96℃加热1.5-2.5min，随后放冰上冷却1.8-2.5min后添加于反应体系中；优选地，所述结合反应的反应条件为24-26℃保温18-22min。优选地，所述电泳包括非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了所述用于检测piRNA与mRNA结合的可视化方法在研究piRNA对基因调控作用中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：目前检测piRNA与mRNA结合的方法主要有双荧光素酶报告基因的方法，但是该技术操作比较繁琐，所需试剂种类多，耗时长，本专利技术通过标记物标记piRNA探针和mRNA探针，混合反应后电泳，然后观察电泳迁移率是否发生改本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测piRNA与mRNA结合的可视化方法，其特征在于，包括：/n(a)提供探针，所述探针为单链RNA，所述探针包括piRNA探针和mRNA探针；/n所述piRNA探针的核苷酸序列为待检测的piRNA的核苷酸序列；/n所述mRNA探针的核苷酸序列为所述待检测的piRNA和mRNA的预测的结合区域的核苷酸序列；/n(b)配置反应体系，所述反应体系包括第一反应体系、第二反应体系和第三反应体系；/n所述第一反应体系中探针为标记的所述piRNA探针；/n所述第二反应体系中探针为标记的所述mRNA探针；/n所述第三反应体系中探针为标记的所述piRNA探针和标记的所述mRNA探针；/n(c)各反应体系进行结合反应，反应后各体系的反应产物经电泳后观察条带，若第三反应体系出现相比于第一反应体系和第二反应体系滞后的条带，则所述待检测的piRNA与mRNA结合。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测piRNA与mRNA结合的可视化方法，其特征在于，包括：
(a)提供探针，所述探针为单链RNA，所述探针包括piRNA探针和mRNA探针；
所述piRNA探针的核苷酸序列为待检测的piRNA的核苷酸序列；
所述mRNA探针的核苷酸序列为所述待检测的piRNA和mRNA的预测的结合区域的核苷酸序列；
(b)配置反应体系，所述反应体系包括第一反应体系、第二反应体系和第三反应体系；
所述第一反应体系中探针为标记的所述piRNA探针；
所述第二反应体系中探针为标记的所述mRNA探针；
所述第三反应体系中探针为标记的所述piRNA探针和标记的所述mRNA探针；
(c)各反应体系进行结合反应，反应后各体系的反应产物经电泳后观察条带，若第三反应体系出现相比于第一反应体系和第二反应体系滞后的条带，则所述待检测的piRNA与mRNA结合。


2.根据权利要求1所述的用于检测piRNA与mRNA结合的可视化方法，其特征在于，所述探针还包括阴性对照探针，所述阴性对照探针与所述piRNA探针和所述mRNA探针均不结合；所述反应体系还包括第四反应体系；
所述第四反应体系中探针为标记的所述piRNA探针、标记的所述mRNA探针和未标记的阴性对照探针；未标记的阴性对照探针的摩尔浓度为标记的所述mRNA探针的20～100倍；
若第四反应体系出现和第三反应体系相同的滞后的条带，则所述待检测的piRNA与mRNA结合；
优选地，未标记的阴性对照探针的摩尔浓度为标记的所述mRNA探针的40～60倍，优选为50倍。


3.根据权利要求1所述的用于检测piRNA与mRNA结合的可视化方法，其特征在于，所述反应体系还包括第五反应体系，所述第五反应体系中探针为标记的所述piRNA探针、标记的所述mRNA探针和未标记的所述piRNA探针，未标记的所述piRNA探针的摩尔浓度为标记的所述mRNA探针的20～100倍；
若第五反应体系无游离的标记的所述mRNA探针条带，则所述待检测的piRNA与mRNA结合；
优选地，未标记的所述piRNA探针的摩尔浓度为标记的所述mRNA探针的40～60倍，优选为50倍。


4.根据权利要求1-3任一项所述的用于检测piRNA与mRNA结合的可视化方法，其特征在于，所述检测piRNA与mRNA结合包括检测has-piR-016659与HNF1A结合；和/或，检测has-piR-020391与ZNF10结合。


5.根据权利要求1-3任一项所述的用于检测piRNA与mRNA结合的可视化方法，其特征在于，当所述反应体系中同时含有标记的所述piRNA探针和标记的所述mRNA探针时，标记的所述piRNA探针和标记的所述mR...

【专利技术属性】
技术研发人员：于典科，许琳，罗娇，靳远，李传海，王颖，郑玉新，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东;37