利用核酸类似物进行靶核酸检测的方法技术

本发明专利技术提供了利用核酸类似物进行靶核酸检测的方法，具体地提供了一种利用核酸类似物进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒，所述的检测方法包括向含有靶核酸的反应体系中加入gRNA、Cas蛋白和单链核酸类似物检测器。

【技术实现步骤摘要】
利用核酸类似物进行靶核酸检测的方法
本专利技术涉及核酸检测领域，涉及利用核酸类似物进行靶核酸检测的方法，尤其涉及利用核酸类似物进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒。
技术介绍
特异性检测核酸分子(Nucleicaciddetection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleicaciddiagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。另一个方面是对人或其他物种的单核苷酸多态性(SNPs,singlenucleotidepolymorphisms)的检测。在基因组水平上去理解遗传变异和生物学功能之间的关系为现代分子生物学提供了新视角，而其中SNPs对生物学的功能、进化和疾病等密切相关，因此SNPs的检测与分析技术的发展尤为重要。目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术(SHERLOCK技术)，Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术(DETECTR技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术(HOLMES技术)。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。在基于CRISPR的核酸检测技术中，核酸探针或者核酸检测器是上述检测技术的关键元件，本专利技术对核酸探针进行了改进，选择了核酸类似物作为探针，从而扩展了该技术的应用范围。
技术实现思路
本专利技术提供了利用核酸类似物进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒。一方面，本专利技术提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸类似物检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸类似物检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸。另一方面，本专利技术还提供了一种用于检测样品中靶核酸的系统或组合物，所述系统或组合物包括V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸类似物检测器，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。另一方面，本专利技术还提供了一种用于检测样品中靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包括V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸类似物检测器，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。另一方面，本专利技术还提供了上述系统或试剂盒在检测样品中靶核酸的应用。另一方面，本专利技术还提供了V型CRISPR/CAS效应蛋白在检测样品中靶核酸中的应用。如上所述的应用，所述V型CRISPR/CAS效应蛋白在与样品中的靶核酸结合或杂交后，可以切割体系中的单链核酸类似物检测器。另一方面，本专利技术还提供了V型CRISPR/CAS效应蛋白在制备检测样品中靶核酸的试剂中的应用。核酸类似物包括，但不限于：2’-O-甲基取代RNA、锁核酸、桥核酸、吗啉核酸、乙二醇核酸、己糖醇核酸、苏糖核酸、阿拉伯糖核酸、2’氧甲基RNA、2’甲氧基乙酰基RNA、2’-氟RNA、2’-氨基RNA、4’-硫RNA及其组合，包括任选的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸残基。锁核酸(LNA)：LNA是2’修饰的核苷，其包含连接所述核苷的核糖糖环的C2’和C4’的双基，所述双基限制或锁定核糖环的构象，其结构式如下所示，LNA的碱基可以选自腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，5-甲基-胞嘧啶，胸腺嘧啶和尿嘧啶。吗啉(Morpholino，MNA)，MNA为吗啉核酸，或称吗啉代核酸，其单体结构如下所示：桥核酸(BNA)，桥核酸，或者称之为桥连核酸，其单体结构如下所示：乙二醇核酸(GNA)，乙二醇核酸单体结构如下所示：苏糖核酸(TNA)，苏糖核酸的单体结构式如下所示：己糖醇核酸(HNA)，己糖醇核酸的单体结构如下所示：阿拉伯糖核酸(ANA)，阿拉伯糖核酸的单体结构如下所示：2’氧甲基RNA(2’O-MethylRNA)，2’氧甲基RNA单体结构如下所示：2’甲氧基乙酰基RNA(2’-O-methoxy-ethylRNA)，单体结构如下所示：2’-氟RNA(2’-FRNA)，单体结构如下所示：2’-氨基RNA(2’-AminoRNA)，单体结构如下所示：4’-硫RNA(4’-SRNA),单体结构如下所示：在一个实施方式中，所述核酸类似物为脱氧核糖尿嘧啶(dU)，所述脱氧核糖尿嘧啶为将尿嘧啶的2’羟基脱掉所形成的脱氧核糖尿嘧啶(dU)。在其他的实施方式中，所述核酸类似物可以为2’氧甲基RNA(2’O-MethylRNA)，或者称之为2’OCH3-RNA，其碱基可以为A、U、C、G，也可以为T；尽管T为脱氧核糖核苷酸，但在存在2’氧甲基修饰时，本领域通常也称之为2’氧甲基RNA。在其他的实施方式中，所述核酸类似物可以为2’-氟RNA(2’-FRNA)，其碱基可以为A、U、C、G、T。在优选的实施方式中，所述单链核酸类似物检测器为寡聚核酸类似物。所述单链核酸类似物检测器不与所述gRNA杂交。进一步的，所述V型CRISPR/CAS效应蛋白选自Cas12、Cas14家族蛋白或其突变体；在一个实施方式中，所述Cas蛋白优选为Cas12家族，包括但不限于Cas12a、Cas12b、Cas12i、Cas12j中的一种或任意几种；所述Cas14家族蛋白选自Cas14a和/或Cas14b。在一个实施方式中，所述Cas12a选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中一种或任意几种；所述Cas12a优选为LbCas12a，氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，或者，将SEQIDNo.1所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。在其他的实施方式中，所述Cas12b的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，或者，将SEQIDNo.2所示氨基酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与V型Cas蛋白(CRISPR/CAS效应蛋白)、gRNA(指导RNA)和单链核酸类似物检测器接触，所述gRNA包括与所述V型Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由V型Cas蛋白切割单链核酸类似物检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述单链核酸类似物检测器不与所述gRNA杂交。/n

【技术特征摘要】
20200618 CN 20201056093271.一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与V型Cas蛋白(CRISPR/CAS效应蛋白)、gRNA(指导RNA)和单链核酸类似物检测器接触，所述gRNA包括与所述V型Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由V型Cas蛋白切割单链核酸类似物检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述单链核酸类似物检测器不与所述gRNA杂交。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链核酸类似物选自锁核酸(LNA)、桥核酸(BNA)、吗啉核酸(MNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、己糖醇核酸(HNA)、阿拉伯糖核酸(ANA)、2’-氧甲基RNA、2’-甲氧基乙酰基RNA、2’-氟RNA、2’-氨基RNA、4’-硫RNA、脱氧核糖尿嘧啶中的一种或任意几种；
优选的，所述核酸类似物为锁核酸(LNA)，脱氧核糖尿嘧啶，2’-氧甲基RNA，2’-氟RNA中的一种或任意几种。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酸类似物的碱基选自腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)，5-甲基-胞嘧啶，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)中的一种或任意几种。


4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述V型Cas蛋白选自Cas12、Cas14家族蛋白的任意一种或任意几种组合；优选的，所述Cas14家族蛋白选自Cas14a、Cas14b中的一种或任意几种组合；更优选的，所述Cas12家族蛋白为Cas12i、Cas12j、Cas12a、Cas12b中的一种或任意几种组合物...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁亚峰，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37