转氨酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种转氨酶突变体及其应用。该转氨酶突变体由SEQ ID NO:2发生一种或多种氨基酸突变得到或者为以野生型CvTA转氨酶的序列SEQ ID为NO：1作为参照，第54‑63位及第84‑96位的保守氨基酸发生突变的突变体。此类突变体的催化活性相比野生型转氨酶均有不同程度的提升，因而利用这些突变体进行手性胺类化合物的合成，尤其是大位阻手性胺的合成，有利于提高生产效率，降低工业生产成本。且采用生物酶进行绿色化学合成，有利于减少工业三废。

【技术实现步骤摘要】
转氨酶突变体及其应用
本专利技术涉及生物酶应用领域，具体而言，涉及一种转氨酶突变体及其应用。
技术介绍
大位阻手性胺化合物（本申请中指潜在手性羰基旁边的基团比甲基大的一类化合物）是一类光学活性物质和功能性分子，是药物和配体合成中广泛应用的重要的手性中间体。然而，目前合成此类手性化合物的相关报道较少，而且无法取得令人满意的结果。例如，羰基一边有大位阻苯基叔丁基氨基酯的选择性为76%（Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,4367）。目前对于小位阻（本申请中指潜在手性羰基旁边的基团为H或甲基的一类化合物）的不对称加氢反应，一些金属催化剂，比如，钌，铑，钯等均有报道取得较好的立体选择性，但是随着羰基临近位阻的变大，催化效果变得较差。不对称加氢是一类对于生产精细化学品以及药物前体的技术，不过这一技术有一些缺点，比如需要使用高压氢气，对生产的安全性造成很大挑战，需要昂贵的过渡金属催化剂，这些有毒的催化剂还需要在后处理过程中小心对待并除去。而且这个过程中需要花费大量的人力物力筛选对应的配体。很多时候这个过程还存在立体选择性不高的问题（Science,2010,329,305）。转氨酶催化的不对称转氨反应为手性胺化合物的合成提供了一种经济、绿色的合成思路。不过，转氨酶结构上天然存在大小两个口袋，因而其能够转化的底物有较大的局限性，目前尚未发现具有对于大位阻的手性胺化合物具有催化活性的转氨酶。一般来说，潜在手性羰基旁边的基团如果比甲基大，转氨酶的小口袋就无法接受。因而转氨酶催化大位阻的手性胺化合物的合成是一个长久以来存在的挑战。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种转氨酶突变体及其应用，以解决现有技术中转氨酶难以催化合成大位阻手性胺化合物的问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种转氨酶突变体，该转氨酶突变体选自：（1）由SEQIDNO:2发生氨基酸突变得到，氨基酸突变为如下任意一种：F22A、L59A、W60A、C61A、F88A、Y89A、K90A、T107A、N151A、Y153A、F166A、Y168A、E171A、K193A、V234A、I262A、I297A、K304A、F320A、T321A、E368A、V379A、L380A、F397A、R405A、F409A、D416A、S417A、C418A、S424A；或者（2）由SEQIDNO:2发生氨基酸突变得到，氨基酸突变为F88A以及以下位置中的任意一种或多种突变：L59、P83、F84、Y85、N86、T87、Y89、K90、T91、F409及A417；或者（3）由野生型转氨酶的保守氨基酸突变得到，以野生型CvTA转氨酶的序列SEQID为NO：1作为参照，保守氨基酸位于SEQIDNO：1的第54-63位及第84-96位，保守氨基酸至少发生如下任意一种突变：L59A、W60A、C61A、F84S/C/G/L/R/V/P/A/M/E/K/W/Q/T/H/D/Y/N/I、Y85M、N86H/Q/P/D/K/Y/S/L/M/I/T/W/F/V/R/S/K/G、T87K/C/E/N/Q/H/F/R/D/I/M/W/A/P/V/S/L/G、F88A、Y89D/A/、K90A/F/G/D/C/S/A/E/L/V/I/R/T/Y/M/H/N/P/Q/W、T91M/W/V/G/C/R/A/F/I/M/E/L/S/K/H/Q/D/N/P/Y，/表示或。进一步地，（3）中，野生型转氨酶为与SEQIDNO：1具有69%以上、优选75%以上，更优选80%以上，进一步优选85%以上同源性，且具有保守氨基酸的野生型转氨酶；优选地，野生型转氨酶来源于表9和表11所示的酶编号为1至54所示的来源中的任意一种。进一步地，（3）中，保守氨基酸发生如下任一种组合突变：（a）L59A+F88A；（b）L59A+F88A+F89D；（c）L59A+F88A+F89D+N86H；（d）L59A+F88A+F89D+N86H+Y85M。进一步地，（1）或（2）中，氨基酸突变为如下任意一种：。为了实现上述目的，根据本专利技术的第二个方面，提供了一种DNA分子，DNA分子编码上述任一种转氨酶突变体。为了实现上述目的，根据本专利技术的第三个方面，提供了一种重组质粒，重组质粒连接有上述DNA分子。为了实现上述目的，根据本专利技术的第四个方面，提供了一种手性胺化合物的合成方法，采用上述任一种转氨酶突变体在氨基供体的作用下对式I所示酮类底物进行转氨基反应，得到手性胺化合物；式I，Ar1表示取代或未取代的芳基或亚芳基，或者取代或未取代的杂亚芳基；Ar2表示取代或未取代的芳基，或者环烷基；以及可选的R，R表示C原子数为1~5的取代或未取代的亚烷基，R与Ar1或Ar2连接成环；其中，取代的芳基或亚芳基、取代的杂亚芳基或取代的亚烷基的取代基选自卤素、羟基或氨基，取代的杂亚芳基中的杂原子选自N、O或S。进一步地，取代的芳基或亚芳基中的取代基为卤素或-S-CH3，卤素或-S-CH3位于芳基或亚芳基的邻位、间位或对位中的任意一个或多个位置，优选地，卤素为F、Cl或Br。进一步地，Ar1表示取代或未取代的芳基或亚芳基，Ar2表示未取代的芳基，R表示C原子数为1~5的未取代的亚烷基，且R与Ar1连接成环。进一步地，Ar1表示未取代的杂亚芳基，Ar2表示卤素取代的芳基，R表示羟基取代的C原子数为1~5的亚烷基，且R与Ar1连接成环。进一步地，Ar1表示卤素和氨基取代的亚芳基，Ar2为碳原子数为3~8的环烷基。进一步地，Ar1表示未取代的环烷基或芳基，Ar2为取代或未取代的环烷基或芳基。进一步地，Ar1表示羟基、甲基、乙基或-S-CH3取代的环烷基或芳基，Ar2为未取代的芳基或烷基。进一步地，酮类底物为：进一步地，氨基供体为异丙胺、异丙胺盐酸盐、丙氨酸、正丁胺或苯胺。应用本专利技术的技术方案，通过筛选出一类对特定底物均具有一定催化活性的转氨酶，并分析此类转氨酶具有保守的氨基酸序列区域，通过对保守区域的氨基酸进行定点突变及定向筛选，从而获得了一系列催化活性比野生型有所提高的转氨酶突变体。利用这些突变体进行手性胺类化合物的合成，尤其是大位阻手性胺的合成，有利于提高生产效率，降低工业生产成本。且采用生物酶进行绿色化学合成，有利于减少工业三废。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1示出了根据本专利技术实施例的多序列（SEQIDNO：1及SEQIDNO：3至SEQIDNO：19）比对的部分结果的示意图；图2示出了根据本专利技术实施例的多序列（SEQIDNO：20至SEQIDNO：38）比对的部分结果的示意图；以及图3示出了根据本专利技术实施例的多序列（SEQIDNO：39至SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体：（1）由SEQ ID NO: 2发生氨基酸突变得到，所述氨基酸突变选自如下任意一种：/n

【技术特征摘要】
1.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体：（1）由SEQIDNO:2发生氨基酸突变得到，所述氨基酸突变选自如下任意一种：
















；
或者
（2）由野生型转氨酶的保守氨基酸突变得到，以野生型CvTA转氨酶的序列为SEQIDNO：1作为参照，所述保守氨基酸发生如下任一种组合突变：（a）L59A+F88A；（b）L59A+F88A+F89D；（c）L59A+F88A+F89D+N86H；（d）L59A+F88A+F89D+N86H+Y85M，所述野生型转氨酶来源于下表所示的酶编号为1至54中的任意一种：




。


2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1所述的转氨酶突变体。


3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求2所述的DNA分子。


4.一种手性胺化合物的合成方法，采用权利要求1或所述的转氨酶突变体在氨基供体的作用下对式I所示酮类底物进行转氨基反应，得到所述手性胺化合物；

式I，
Ar1表示取代或未取代的芳基或亚芳基，或者取代或未取代的杂亚芳基；
Ar2表示取代或未取代的芳基，或者环烷基；以及
可选的R，R表示C原子数为1~5的取代或未取代的亚烷基，所述R与所述Ar1或Ar2连接成环；
其中，所述取代的芳基或亚芳基、所述取代的杂亚芳基或所述取代的亚烷基的...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯·盖吉，肖毅，张娜，焦学成，马玉磊，牟慧艳，王祖建，孙凯华，李响，赵桐，曹珊，
申请(专利权)人：凯莱英医药集团天津股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12