肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560、噬菌体解聚酶Depo43及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560的、噬菌体解聚酶Depo43及应用。本发明专利技术噬菌株P560于2020年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名为Klebsiella pneumonia phage P560，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020643。该噬菌株P560的第43位开放阅读框进行原核表达和纯化能获得噬菌体解聚酶Depo43，该解聚酶不但能够清除K47和K64型肺炎克雷伯氏菌所形成的荚膜多糖，并且对生物被膜的形成具有高效的抑制作用，可广泛应用于制备抗生素替代制剂及医疗器械消毒剂中，具有显著地临床效果。

【技术实现步骤摘要】
肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560、噬菌体解聚酶Depo43及应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560，来源于该肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560的解聚酶Depo43以及解聚酶Depo43的制备与应用。
技术介绍
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)是一种常见的人畜共患病原菌。近年来，多重耐药肺炎克雷伯氏菌已成为医源性感染的最主要病原体之一。该细菌不但对人类公共卫生事业造成了巨大威胁，而且在一定程度影响了动物养殖业的健康发展。大多数肺炎克雷伯氏菌具有合成和分泌荚膜多糖的能力。荚膜多糖作为细菌的天然屏障可维持细菌毒力、粘附、阻断一些抗生素渗透。作为肺炎克雷伯氏菌的重要毒力因子，荚膜多糖对公众健康构成巨大威胁。此外，一些肺炎克雷伯氏菌可形成生物被膜，即由细菌自身产生的胞外多糖基质、脂蛋白、纤维蛋白等所包裹的细菌细胞所形成的膜状结构，能显著提高细菌对抗生素的耐药性及逃避宿主免疫系统识别的能力，从而加速细菌在病灶内的定植。因此，生物被膜是医院内细菌感染的主要致病因素。另外，生物被膜能够稳定地附着于医用器械表面，通过常规物理化学手段难以清除，这给防控医疗继发感染带来了严峻考验。噬菌体解聚酶(depolymerase)通过降解细菌表面多糖，进而引导噬菌体吸附于宿主外膜蛋白。该酶通过随机攻击糖苷键以释放聚合物的重复单元，实现靶向降解荚膜多糖。诸多国内外研究表明，噬菌体解聚酶可有效清除并抑制生物被膜的形成，在控制病原感染等公共卫生领域具备一定的应用潜力。但是，不同来源、不同核酸序列以及不同蛋白结构的噬菌体解聚酶，对不同类型的荚膜多糖和生物被膜所表现的降解性能也是有非常大的差别。例如，文献：“BiologicalpropertiesandgenomicsanalysisofvB_KpnS_GH-K3,aKlebsiellaphagewithaputativedepolymerase-likeprotein，VirusGenes(2019)55:696–706”公开了一种噬菌体解聚酶样蛋白，该蛋白表明只对K2型起作用，对K47型和K64型的肺炎克雷伯氏菌的荚膜多糖和生物被膜并没有降解效果。申请号为CN201811349779.2、名称为“降解肺炎克雷伯氏菌荚膜多糖及生物被膜的噬菌体解聚酶”的专利公开了一种噬菌体解聚酶及其应用，但是并没有公开该噬菌体解聚酶的实际作用谱，并没有任何迹象表明该噬菌体解聚酶有何应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560。本专利技术的再一目的在于提供由上述肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560制备得到的噬菌体解聚酶Depo43。本专利技术的另一目的在于提供上述噬菌体解聚酶Depo43的制备过程及其相关应用。本专利技术是这样实现的，一种肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560，所述的噬菌株P560于2020年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉大学保藏中心，邮编：430072，保藏名为KlebsiellapneumoniaphageP560，保藏编号为：CCTCCNO：M2020643。本专利技术进一步公开了一种由上述肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560制备得到的噬菌体解聚酶Depo43，该噬菌体解聚酶Depo43的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示，该噬菌体解聚酶Depo43的氨基酸序列如SEQIDNo：1所示。优选地，该噬菌体解聚酶Depo43为肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560第43位开放阅读框的原核表达和纯化产物。本专利技术进一步公开了上述噬菌体解聚酶Depo43的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)通过PCR、双酶切、连接分子克隆手段获得肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560第43位开放阅读框的depo43基因片段，将该depo43基因片段连接至pET28a质粒上，得到pET28a-depo43质粒；(2)将pET28a-depo43质粒转化到大肠杆菌BL21，筛选得到BL21-depo43大肠杆菌，将该BL21-depo43大肠杆菌在1L含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期；(3)向上述LB液体培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为0.3mM，16℃180转/分振荡诱导表达16小时；(4)将诱导表达的BL21-depo43菌液离心集菌离心后进行超声破碎，将上清液样品加入Ni-NTA亲和层析柱，洗涤Ni柱以去除杂蛋白，最后收集洗脱液并经超滤得到纯化的噬菌体解聚酶Depo43。本专利技术进一步公开了上述噬菌体解聚酶Depo43在降解肺炎克雷伯氏菌的荚膜多糖及生物被膜中的应用。优选地，所述肺炎克雷伯氏菌包括K47型和K64型肺炎克雷伯氏菌。本专利技术进一步公开了上述噬菌体解聚酶Depo43在制备抗生素替代制剂及医疗器械消毒剂中的应用。相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术公开了一种肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560，通过对肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560第43位开放阅读框(orf43)，进行原核表达和纯化而获得了噬菌体解聚酶Depo43，该解聚酶不但能够清除K47和K64型肺炎克雷伯氏菌所形成的荚膜多糖及生物被膜，并且对生物被膜的形成具有高效的抑制作用，可广泛应用于制备抗生素替代制剂及医疗器械消毒剂中，具有显著地临床效果。附图说明图1为本专利技术噬菌体解聚酶Depo43阳性原核表达菌株PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；图2为本专利技术噬菌体解聚酶Depo43的SDS-PAGE电泳图；图3为实施例中不同浓度的解聚酶Depo43对K47型肺炎克雷伯氏菌Kp42的抑制效果图；图4是基于扩散法检测解聚酶Depo43对荚膜多糖的解聚效果图；图5为实施例中Depo43抑制肺炎克雷伯氏菌生物被膜检测结果。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1噬菌体解聚酶Depo43的制备(1)目的产物扩增设计用于构建解聚酶表达载体的引物：上游引物F(SEQIDNo:3)为：5’-GGAATTCCATATGTTAAACAATCTGAATCAG-3’；下游引物R(SEQIDNo:4)为：5’-CCGCTCGAGTTATGGACCAATGACCACACC-3’。PCR扩增程序为95℃变性3min；95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环。将来自肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560第43位开放阅读框的depo43基因PCR产物经酶切纯化后连接至pET28a质粒：酶切位点NdeI和XhoI；(2)将pET28a-depo43质粒加入到100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560，所述噬菌株P560于2020年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名为Klebsiella pneumonia phage P560，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020643。/n

【技术特征摘要】
1.一种肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560，所述噬菌株P560于2020年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名为KlebsiellapneumoniaphageP560，保藏编号为：CCTCCNO：M2020643。


2.由权利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560制备得到的噬菌体解聚酶Depo43，该噬菌体解聚酶Depo43的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。


3.如权利要求2所述的噬菌体解聚酶Depo43，其特征在于，该该噬菌体解聚酶Depo43为肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560第43位开放阅读框的原核表达和纯化产物。


4.权利要求2所述噬菌体解聚酶Depo43的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)通过PCR、双酶切、连接分子克隆手段获得肺炎克雷伯氏菌噬菌株P560第43位开放阅读框的depo43基因片段，将该depo43基因片段连接至pET28a质粒上，得到pET28a-depo43质粒；

【专利技术属性】
技术研发人员：张炜，李敏，杜鸿，李培，肖宇屹，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32