一种伪狂犬病毒QD株三基因缺失致弱株制造技术

本发明专利技术提供一种猪伪狂犬病毒QD株gE

【技术实现步骤摘要】
一种伪狂犬病毒QD株三基因缺失致弱株
本专利技术属于疫苗制备
，具体涉及一种伪狂犬病毒QD株gE-/gI-/11K-三基因缺失致弱株。
技术介绍
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒(PseudorabiesVirus，PRV)引起的急性传染病。PRV为疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，主要感染对象为猪也可以感染牛、羊、犬等家畜和部分野生动物。猪是PRV的主要传染源，主要表现为母猪繁殖性障碍和仔猪死亡，15日龄内的仔猪死亡率高达100％。PRV的传播给养猪业带来的巨大损失。目前无特效药物治疗伪狂犬病，疫苗是用于防范此病的主要方法。现今使用最广泛的PRV疫苗株是Bartha-K61，Bartha株可为猪场提供良好的保护。但近来Bartha株的免疫不能完全保护猪只免受PRV野毒株的攻击，因此需要针对流行毒株制备相应的基因缺失疫苗，以用于PRV流行毒株的防控工作。由于伪狂犬病毒基因组庞大，通过直接的基因编辑方法无法达到期望的效率。目前常用方法有如下两种，第一种方法是同源重组的方法，即依据伪狂犬病毒的复制特性将病毒基因组和重组质粒共同转染易感细胞发生自然重组，通过蚀斑纯化的方法得到重组的单克隆病毒。这种方法操作相对简便，具有较高的成功率。第二种方法是人工染色体的方法，即将完整的伪狂犬病毒整合入特殊的大肠杆菌基因组中，此后的重组工作均在人工染色体上操作，然后将编辑过的基因组转染易感细胞得到重组病毒。由于细菌生长迅速便于筛选极大地增加后期操作效率，但人工基因组的构建门槛较高不易得，不适合快速操作。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪伪狂犬病毒QD株gE-/gI-/11K-三基因缺失致弱株，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种猪伪狂犬病毒基因缺失株，是对猪伪狂犬病病毒株进行gE和gI和11K基因进行缺失后制成的。所述的猪伪狂犬病病毒株，为猪伪狂犬病病毒株PRV-QD株，其保藏编号为CGMCCNo.10266。本专利技术所提供的猪伪狂犬病毒基因缺失株可以用作疫苗株来制备疫苗；所述的疫苗为活疫苗。本专利技术再一个方面提供一种猪伪狂犬病病毒疫苗，由抗原和保护剂组成的，其中抗原包含有上述的猪伪狂犬病毒基因缺失株。本专利技术制备的疫苗株可有效预防猪伪狂犬病，而且作为抗原的猪伪狂犬病病毒为基因缺失株，在保留免疫原性的同时极大的降低了病毒毒力且遗传稳定性良好，符合猪伪狂犬病病毒缺失疫苗株无毒力返强的标准，制成的疫苗能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。附图说明图1：重组质粒构建示意图；图2：pB-arm质粒酶切鉴定图，其中M为DL5000Marker；1为pB-arm质粒EcoRI单酶切片段；图3：pB-EGFP-arm质粒酶切鉴定图，其中M为DL5000Marker；1为pB-EGFP-armEcoRI单酶切片段；图4：重组病毒蚀斑纯化照片图；图5：纯化蚀斑重组鉴定图，其中上EGFP重组鉴定扩增片段；下gE/gI基因缺失鉴定扩增片段，M为DL2000Marker；P为PRV母本毒株阳性对照；1～6为不同蚀斑鉴定；图6：纯化病毒绿色荧光鉴定图(×200)；图7：PRVQD-gE-/gI-株PCR鉴定图，其中M为DL5000Marker；1为PRV母本毒株对照扩增片段；2为基因缺失毒株扩增片段；图8：PRVQD-gE-/gI-株gE/gI基因mRNA转录鉴定图，其中M为DL2000Marker；1为PRV母本毒株gEmRNA扩增片段；2为PRV母本毒株gImRNA扩增片段；3为PRV母本毒株11KmRNA扩增；4～为6PRVQD-gE-/gI-/11K-gE、gI、11KmRNA扩增；图9：毒株增殖曲线图。具体实施方式本专利技术所使用的猪伪狂犬病病毒PRV-QD流行毒株(猪伪狂犬病病毒QD株疱疹病毒Ⅰ型)(porcineherpesvirusType)，由我实验室分离鉴定与保存。2015年3月6日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10266，保藏地址中国北京。对PRV-QD毒株进行PCR检测，测序后进行blast分析，发现保该病毒株的gE基因与2012年之后报道的猪伪狂犬病病毒的相对应的序列虽然存在至少2个氨基酸的差异，但是亲缘关系较近，均处于一个相对独立的分支中，与之前分离的毒株亲缘关系较远。且与最近分离的毒株具有相同的分子特征，即在gE基因第48位和第492-496位各有1个天冬氨酸的插入。因此可以推测上述的差异正是导致已有的猪伪狂犬病病毒疫苗免疫效果不佳的原因所在。该毒株作100倍稀释后，与等量猪伪狂犬病病毒抗血清中和，病毒均能被高免血清特异性中和；而与等量猪细小病毒、猪流感病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒抗血清中和组，细胞呈现明显的细胞病变，可见该病毒特异性好。在该保藏毒株的基础上，通过同源重组方法缺失gE、gI、11K三个基因片段来降低野毒株毒力，从而可以直接使用基因缺失株来制备活疫苗。实施例1：构建PRV-QD的gE、gI、11K三个基因缺失株1、重组载体的构建以PRVHLJ8株(Genebank：KT824771)为参考，设计缺失短独特区(UniqueShort，US)完整US7(gI)基因，完整的US8(gE)基因以及US9(11K)基因。分别设计引物扩增缺失基因两侧同源臂，引物见表1。表1：引物的序列信息表分别使用5'armF/5'armR和3'armF/3'armR引物建立50μL扩增体系：2×PrimeSTARHSGCBuffer25μL；dNTP(2.5mMeach)4μL；Forwardprimer1μL；Reserveprimer1μL；PRV基因组DNA1μL；PrimeSTARHS0.5μL；去离子水17.5μL。反应条件：98℃预变性3min；98℃10s，55℃5s，72℃1kb/min，扩增30循环。扩增产物分别为同源重组所需的5’端arm片段和3’arm片段，两片段送由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。提取pBluescriptIIKS(+)质粒，经BamHI和SalI双酶切获得线性质粒片段。使用ClonExpressMultiSOneStepCloningKit试剂盒50℃连接15min，将5’arm和3’arm片段同时连入pBluescriptIIKS(+)载体中并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，获得重组质粒经测序正确后命名为pB-arm。以pcDNA3.1-EGFP质粒为模板，以EGFPcasF/EGFPcasR为引物扩增EGFP表达盒片段，反应体系和条件同上。表达盒序列原件包括CMV启动子、EGFP阅读框及bGHpolyA加尾信号。扩增EGFP表达盒片段和pB-arm质粒经EcoRI酶切，使用DNALigationKitVer.2.1试本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪伪狂犬病毒基因缺失株，其特征在于，所述的猪伪狂犬病毒基因缺失株是对猪伪狂犬病病毒株进行gE和gI和11K基因进行缺失后制成的。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病毒基因缺失株，其特征在于，所述的猪伪狂犬病毒基因缺失株是对猪伪狂犬病病毒株进行gE和gI和11K基因进行缺失后制成的。


2.如权利要求1所述的猪伪狂犬病毒基因缺失株，其特征在于，所述的猪伪狂犬病病毒株的保藏编号为CGMCCNo.10266。

【专利技术属性】
技术研发人员：于泽坤，单学强，只勇，张伦，李思菲，段笑笑，栾志舫，杨海明，杨彦超，郝光恩，马广斌，赵炳光，朱焕星，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，青岛信得药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37