迟钝爱德华氏菌高效裂解性噬菌体vB_EtaM-IME523及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种迟钝爱德华氏菌高效烈性噬菌体vB_EtaM‑IME523及其应用，涉及迟钝爱德华氏菌污染和感染的生物处理。vB_EtaM‑IME523保藏于微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18191。vB_EtaM‑IME523具有呈现二十面体近似球形的头部，直径约为95nm，可以收缩的尾部，长度约为125nm；vB_EtaM‑IME523在迟钝爱德华氏菌的菌平板上可以形成透明的噬菌斑，可裂解迟钝爱德华氏菌，使菌液澄清化；vB_EtaM‑IME523对动物有明显的保护作用。vB_EtaM‑IME523的应用，用于特异性地抑制、杀死迟钝爱德华。

【技术实现步骤摘要】
迟钝爱德华氏菌高效裂解性噬菌体vB_EtaM-IME523及其应用
本专利技术涉及一种病原菌的噬菌体，尤其是涉及一种迟钝爱德华氏菌高效烈性噬菌体vB_EtaM-IME523及其应用。
技术介绍
为了防控疾病，抗生素和化学消毒剂被长期、广泛使用。然而，抗生素易诱发细菌产生耐药性，形成″超级细菌″，严重威胁人类和动物健康；抗生素和化学消毒剂没有专一性，破坏我们依赖的正常菌群，损害健康并危害环境的生态平衡；抗生素和化学消毒剂在养殖产品中残留，被人体摄入后，会影响肠道细菌群落、抑制免疫系统，危害人类健康。噬菌体(phage)是感染细菌、真菌的病毒。裂解性噬菌体又称为烈性噬菌体或者毒性噬菌体(virulentphage)。烈性噬菌体特异性侵染目标细菌，将其裂解，并且不感染人和动、植物，也不会对正常微生物群落和环境造成污染，噬菌体具有宿主依赖性，随宿主的清除而消亡，不会残留在动物体内。烈性噬菌体安全性高，是最具潜力的抗生素替代品，在抗菌药物研发方面具有巨大的潜力和优势。迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，爱德华氏菌属(Edwardsiella)的代表菌，该菌为革兰氏阴性、兼性厌氧菌，分布非常广泛，是“人-兽-鱼”共患性条件致病菌，能够引起各类哺乳动物以及鱼、虾、蟹、鳖等感染发病，可导致腹泻、败血症、腰大肌与硬膜外脓肿等，甚至可引起死亡。摄食迟钝爱德华氏菌污染的水产品可能造成严重的食源性感染。近年来，迟钝爱德华氏菌引发的鱼类病害屡见不鲜，在水产养殖当中，由迟钝爱德华氏菌引发的病害曾在全国多省份暴发性流行，给养殖户造成了巨大的经济损失。研发能够高效裂解迟钝爱德华氏菌的噬菌体具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可高效、快速地裂解迟钝爱德华氏菌的新的噬菌体及其应用。该噬菌体特异性感染、裂解迟钝爱德华氏菌，对动物有保护作用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种以致病性迟钝爱德华氏菌为靶标分离获得的特异侵染迟钝爱德华氏菌的新的裂解性噬菌体，依据噬菌体命名原则命名为vB_EtaM-IME523(vB_EtaM即Virusofbacteria，Edwardsiellatarda，Myoviridae的缩写；IME523为株号)，其分类上属于肌尾科Myoviridae。vB_EtaM-IME523于2019年7月10日，保藏于微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.18191，保藏机构地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。噬菌体vB_EtaM-IME523对动物有保护作用，对斑马鱼的相对保护率为46.7％。该噬菌体的生物学特征如下：噬菌体vB_EtaM-IME523具有呈现二十面体近似球形的头部，直径约为95nm，可以收缩的尾部，长度约为125nm；噬菌体vB_EtaM-IME523在迟钝爱德华氏菌的菌平板上可以形成透明的噬菌斑；噬菌体vB_EtaM-IME523可裂解迟钝爱德华氏菌，使菌液澄清化；vB_EtaM-IME523的宿主范围具有种特异性。上述噬菌体vB_EtaM-IME523的分离纯化方法，具体包括如下步骤：(1)迟钝爱德华氏菌的活化、培养迟钝爱德华氏菌来源于军事医学科学院流行病学研究所。取迟钝爱德华氏菌菌种划线接种于含1.5％(W/V)琼脂的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。从平板上挑取单菌落，接种到装有5mLLB液体培养基的试管内，摇床(37℃、220rpm)培养12小时。从试管中取1mL液体培养液1∶100(V/V)稀释至装有100mLLB液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床(37℃、220rpm)上扩大培养至菌液OD600≈0.5，即得到对数期菌液。(2)噬菌体的富集噬菌体vB_EtaM-IME523分离自北京市中国人民解放军总医院第五医学中心污水(Northlatitude：39.8622002；Eastlongitude：116.2957407)。将5L污水用中性滤纸进行过滤处理后，离心12000rpm，5min，收集上清；将上清用0.22μm的滤器过滤后，装入30kD的透析袋中，在透析袋周围撒上PEG8000进行浓缩，过夜后，收集透析袋中剩余液体；取200μL该液体加入5mL用LB液体培养基培养至对数期的迟钝爱德华氏菌中，37℃，220rpm过夜培养；将该混合培养液于12000rpm离心2min，收集上清，上清用0.22μm的滤器过滤细菌，所得滤液即为噬菌体富集后的原液。以常规LB固体培养基(含1.5％琼脂)平板为下层平板，取500μL培养至对数期的迟钝爱德华氏菌加入42-45℃上层半固体LB培养基(含0.7％琼脂)中，立即混匀并倾倒至下层平板上，待上层平板凝固后。取噬菌体富集后的原液滴入对应的双层平板中，共滴三个区，每个滴2μL；对照区滴PBS作为对照。滴液被培养基吸收后，将双层平板倒置于37℃恒温培养箱培养9h，观察、确定噬菌环的出现。(3)噬菌体的纯化培养取100μL确认可导致噬菌环的噬菌体富集后的原液，用PBS缓冲液梯度稀释至8个滴度(10-1～10-8)，各取100μL稀释液与500μL培养至对数期(OD600值约为0.5左右)的迟钝爱德华氏菌混合均匀，静置孵育10min，然后将混合液体分别加入5mL42-45℃的上层半固体LB培养基中，立即混匀并含有下层固体LB培养基的培养皿中，凝固后倒置37℃培养箱中培养9h；从噬菌斑分布均匀的双层平板中，用剪口的无菌枪头挑取形态大小有差异的噬菌斑分别接种至5mL的培养至对数期的迟钝爱德华氏菌中，37℃，220rpm过夜培养；将过夜培养液12000rpm离心2min，收集上清，利用0.22μm的滤器进行过滤；取过滤液重复上述双层平板噬菌斑试验，三代后得到的噬菌斑形态大小均一，取第三代噬菌斑和对数期迟钝爱德华氏菌液的混合培养液离心12000rpm离心2min，上清经0.22μm的滤器过滤，过滤液即为纯化培养的噬菌体悬液。(4)噬菌体的扩大培养取迟钝爱德华氏菌单克隆菌落至液体LB培养基中，37℃，220rpm培养至对数期；然后取该菌液100μL接种于5mL的LB液体培养基中，共接3管，标记为1，2，3，37℃，220rpm培养至对数期；将管1的菌液加入至1000mL的新鲜配制的无菌LB液体培养基中，37℃，220rpm培养至对数期；将500μL步骤(3)纯化培养的噬菌体悬液接种至管2中，37℃，220rpm培养5h；管3为管2的对照组，加入500μL的LB培养基，37℃，220rpm培养5h，用于判断管2内菌液裂解程度；将管2内培养液分装于离心管中，12000rpm离心2min收集上清，加入已培养至对数期的1000mL宿主菌液中，37℃，220rpm过夜培养。(5)噬菌体的浓缩与纯化将步骤(4)制备的1000mL的噬菌体裂解培养物于12000rpm离心2min，收集上清，利用0.22μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.迟钝爱德华氏菌的一种烈性噬菌体vB_EtaM-IME523，该噬菌体于2019年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18191。/n

【技术特征摘要】
1.迟钝爱德华氏菌的一种烈性噬菌体vB_EtaM-IME523，该噬菌体于2019年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.18191。


2.根据权利要求1所述的迟钝爱德华氏菌的一种烈性噬菌体vB_EtaM-IME523，该噬菌体具有如下生物学特征：是以致病性迟钝爱德华氏菌为靶标分离获得的噬菌体，命名为vB_EtaM-IME523；vB_EtaM-IME523使致病性迟钝爱德华氏菌菌液澄清化，在其菌平板上可以形成透明的噬菌斑。


3.根据权利要求1所述的迟钝爱德华氏菌的一种烈性噬菌体vB_EtaM-IME523，该噬菌体具有如下生物学特征：呈现二十面体近似球形的头部，直径95nm，以及可收缩的尾部，长度为125nm。


4.根据权利要求1所述的迟钝爱德华氏菌的一种烈性噬菌体vB_EtaM-IME523，该噬菌体具有如下生物学特征：分离自北京市中国人民解放军总医院第五医学中心污水，位置为Northlatitude：39.8622002，Eastlongitude：116.2957407；具体制备方法如下：
(1)迟钝爱德华氏菌的活化、培养
取迟钝爱德华氏菌菌种划线接种于含1.5％琼脂的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜；从平板上挑取单菌落，接种到装有5mLLB液体培养基的试管内，摇床上于37℃、220rpm培养12小时；从试管中取1mL培养液稀释至装有100mLLB液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床上37℃、220rpm培养至菌液OD600≈0.5，即得到对数期菌液；
其中所用的LB培养基的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，用蒸馏水定容至1L，调pH至7.0，121℃高压灭菌20min；
(2)噬菌体的富集
取北京市中国人民解放军总医院第五医学中心污水，用中性滤纸进行过滤处理后，离心12000rpm、5min，收集上清；将上清用0.22μm的滤器过滤后，装入30kD的透析袋中，在透析袋周围撒上PEG8000进行浓缩，过夜后，收集透析袋中剩余液体；取200μL该液体加入5mL用LB液体培养基培养至对数期的迟钝爱德华氏菌中，37℃，220rpm过夜培养；取将该混合培养液于12000rpm离心2min，收集上清，上清用0.22μm的滤器过滤，所得滤液即为噬菌体富集后的原液；
以常规含1.5％琼脂的LB固体培养基平板为下层平板，取500μL培养至对数期的迟钝爱德华氏菌加入42-45℃的含有0.7％琼脂的半固体LB培养基中，立即混匀并倾倒至下层平板上，待上层平板凝固后，取噬菌体富集后的原液滴入对应的双层平板中，共滴三个区，每个滴2μL；对照区滴0.01MPBS作为对照。滴液被培养基吸收后，将双层平板倒置于37℃恒温培养箱培养9h，观察、确定噬菌环的出现；
其中，0.01M的PBS配方如下：NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、KH2PO40.2g，加水至1L，pH7.4，121℃高压灭菌20min；
(3)噬菌体的纯化培养
取100μL确认可导致噬菌环的噬菌体富集后的原液，用0.01MPBS缓冲液梯度稀释至8个稀释度(10-1～10-8)，各取100μL稀释液与500μL培养至对数期的迟钝爱德华氏菌混合均匀，静置孵育10min，然后将混合液体分别加入5mL42-45℃的上层半固体LB培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：林威，李登峰，孙智同，童贻刚，许丽华，秦伟南，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33