鸭源鹅细小病毒人工致弱毒株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及保藏号为CGMCC No.15700的鹅细小病毒弱毒株GPV‑ZYM及其用作疫苗预防鸭或鹅感染鸭短喙综合征和/或小鹅瘟的应用。

【技术实现步骤摘要】
鸭源鹅细小病毒人工致弱毒株及其应用
本专利技术属于生物领域。具体地，涉及鸭源鹅细小病毒人工致弱毒株及其应用。
技术介绍
近年来，在我国福建省[1]、山东省[2]、安徽省[3]和福建[4]等省份的半番鸭和樱桃谷鸭中暴发流行新型鹅细小病毒病，鸭群感染后临床表现为发育迟缓、喙萎缩、舌头向外伸等，俗称大(长)舌病、或短喙-侏儒综合征等。该病多侵害10～30日龄的肉鸭，发病率15-100％，死亡率3-10％。患鸭出栏体重较健康鸭降低20-30％5]，严重者仅为正常体重的50％[6]。目前，该病的发病区域不断扩大，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。传统的鹅细小病毒病又称小鹅瘟，以雏鹅小肠纤维素性、栓塞性病变为主要特征，具有传播快、死亡率高等特性。GPV主要感染30日龄以内的雏鹅和雏番鸭，临床表现为坏死性肠炎，死亡率高达80％-100％[7]。虽然小鹅瘟病原与短喙-侏儒综合症的病原在分类学上都属于鹅细小病毒，两者的同源性高达98.7％。但是，由于其感染的宿主不同，发病症状不同。至今没有人报道两个病毒的致病机理。1995年，Z.Zádori等首次发表了GPV的全基因组序列。GPV基因组约5100个核苷酸组成，基因组两端为回文序列折叠形成的发夹结构，基因组中均含有两个开放阅读框架(ORF)[8]。左侧ORF编码两个非结构蛋白NS1和NS2；右侧ORF编码三个结构蛋白VP1，VP2和VP3，其中VP3为衣壳蛋白，是主要的免疫保护性抗原，能诱导产生中和作用抗体。由于鹅细小病毒属于DNA病毒，因此，它的变异极为缓慢。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种鹅细小病毒毒株GPV-ZYM，该毒株优选用作疫苗保护鸭避免感染鸭短喙综合征和/或雏鹅(番鸭)小鹅瘟。该毒株于2018年5月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国，北京)，保藏编号为CGMCCNo.15700。具体地，本专利技术涉及以下几个方面：2.鹅细小病毒毒株GPV-ZYM，该毒株的保藏编号为CGMCCNo.15700。其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。3.疫苗，其包含项目1所述的鹅细小病毒毒株GPV-ZYM，在制备预防鸭或鹅感染鸭短喙综合征和/或小鹅瘟的疫苗中的应用。4.制备鸭短喙综合征和/或小鹅瘟疫苗的方法，包括将项目1所述的鹅细小病毒弱毒株GPV-ZYM接种鹅胚成纤维细胞GEF，37℃培养至细胞病变80％以上时，收集病毒培养液，病毒含量在TCID50大于等于104/0.1ml时用于配制疫苗。本专利技术将临床分离到的引起鸭短喙侏儒综合症(Beakatrophyanddwarfismsyndrome，BADS)的新型鸭源鹅细小病毒毒株经过鹅胚成纤维细胞连续传代培养3代后，再接种SPF金锭鸭胚，如此反复交替传代120代，获得毒性减弱的鹅细小病毒致弱毒株GPV-ZYM。该弱毒株与GenBank其他GPV毒株同源性在93.5-97.2％之间。该致弱毒株GPV-ZYM与我国商品化弱毒疫苗GD株(DQ665790)和疫苗SYG61-41毒株(DQ299942)在核苷酸上的同源性分别为92.8％和93.0％，氨基酸同源性分别为95.3％和95.9％。表明弱毒株GPV-ZYM来自人工致弱毒株而非疫苗株。该毒株5‘非编码区带有GPV-ZYM弱毒株特有的分子标记GAACGAAC和GTTCGTTC。其他GenBank毒株以及商品化疫苗株没有该分子标记。该毒株培养物经1∶100倍稀释后，对樱桃谷肉鸭短喙综合症提供100％保护；并且对雏鹅或雏番鸭小鹅瘟也可提供100％的保护。1日龄雏鹅或雏番鸭只需免疫一次，第5天就能全程100％有效预防雏鹅或雏番鸭小鹅瘟病毒感染和鸭短喙综合症的发生。由其制备的活疫苗具有高效、安全、成本低的优点。本专利技术的目的是保护鸭短喙综合症以及雏鹅和雏番鸭小鹅瘟的新型鸭源鹅细小病毒细胞致弱活疫苗的制备方法，本专利技术通过如下技术方案实现：本专利技术利用GEF和SPF鸭胚交替连续传代致弱的GPV-ZYM毒株为种毒，应用GEF制备的的活疫苗具有高效、安全、成本低的优点。附图说明：图1：免疫组化检测鹅细小病毒GPV-ZYM和强毒YG感染雏鸭小肠(A)和肝脏(B)抗原分布。具体实施方式：下面通过参考实施例详细描述本专利技术。本领域的普通技术人员应当理解，下述实施例仅是用于举例说明本专利技术的目的，其不应被以任何方式解释为对本专利技术的限制。本专利技术的保护范围由后附的权利要求所限定。实施例1.人工致弱的新型鹅细小病毒弱毒株GPV-ZYM株的获得2015年在山东某樱桃谷鸭场爆发了疑似鸭短喙侏儒综合症，送检的鸭子均具有明显的短喙、长舌、瘦小等症状。死鸭体内充血严重，肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、小肠、胰脏都出血严重，甚至变性坏死。将病料进行研磨上清接种鸭胚，经鉴定为新型鹅细小病毒GPV。前期研究表明GPV在鹅胚成纤维细胞(GEF)和鸭胚成纤维细胞(DEF)中连续交替传代与其毒力的减弱有着重要的关系[9-11]。随着病毒在细胞中的连续传代培养，宿主细胞与病毒的不断相互作用，使得病毒的毒力相关基因受到修饰而发生改变，使其毒力减弱甚至失去对宿主动物的致病能力。我们将新分离到的引起鸭短喙-侏儒综合征的新型鹅细小病毒GPV在GEF和SPF金锭鸭胚进行连续交叉传代培养，期望获得可以预防鸭短喙-侏儒综合征的弱毒株。具体过程如下：将ZYM亲本毒株传代3代后，接种SPF金锭鸭胚(购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心)，待鸭胚死亡后立即收获尿囊液，按照1∶100倍稀释后，接种由鹅胚制备的GEF(购自哈市道里区新立养殖场)，培养6天收获病毒培养物，反复冻融三次后-70℃保藏。GEF培养物按照1∶100倍稀释后，SPF金锭鸭胚继续培养一代，然后在GEF中连续培养3代，在相同的培养条件下，将最后一次培养物，按照1∶100倍稀释接种SPF金锭鸭胚，收获病毒培养物，如此反复交替连续传代120代次。传代第120代次的毒株命名为GPV-ZYM。根据Reed-Muench方法，计算细胞毒TCID50。第120代次毒株(命名为GPV-ZYM)生物学特征如下：(1)毒株效价：在鹅胚成纤维细胞中效价更高，可达TCID50＞108.0/0.1ml；(2)生物学信息分析：P120代GPV-ZYM与亲本病毒(亲本毒株经测序全基因如SEQIDNO：9所示，NS蛋白和VP1蛋白的序列如SEQIDNO：10和11所示)结构蛋白(VP1)之间的同源性仅为97.4％。致弱毒株GPV-ZYMVP3与我国商品化弱毒疫苗GD株(DQ665790)和SYG61-41毒株(DQ299942)在核苷酸上的同源性分别为92.8％和93.0％，氨基酸上同源性分别为95.3％和95.9％。GPV-ZYM在非编码区分别带有该弱毒株特有的分子标记GAACGAAC和GTTCGTTC。(3)安全性：1-2日龄无GPV母原抗体健康雏鹅和雏番鸭各10只，每只肌肉注射种毒1∶1000倍稀释的GPV-ZYM和鹅细小病毒强毒YG[本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鹅细小病毒弱毒株GPV-ZYM，该毒株的保藏编号为CGMCC No.15700。/n

【技术特征摘要】
1.鹅细小病毒弱毒株GPV-ZYM，该毒株的保藏编号为CGMCCNo.15700。


2.鹅细小病毒GPV-ZYM全基因组序列如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：张云，刘明，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23