一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种艾塞那肽的分离纯化方法，具体涉及一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法，包括以下步骤：粗肽的预处理，溶样，粗纯，离子交换，换盐，冻干。将艾塞那肽粗肽进行超声溶解经滤膜过滤后利用高效液相色谱法上样进行粗纯，收集粗纯后纯度大于90％以上的部分进行离子交换，离子交换后收集其中纯度大于95％以上的部分进行换盐，将换盐之后的合格纯品进行浓缩冻干。本发明专利技术改进了传统方法纯化艾塞那肽的弊端，将离子交换放在粗纯之后进行，给后续的提纯过程提供了便利，且具有良好的分离效果，在粗纯流动相采用磷酸替代传统的三氟乙酸，纯化效果更优，整个纯化过程所用时间更少，收率更高，为大规模纯化醋酸艾塞那肽提供了方向。

【技术实现步骤摘要】
一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法
本专利技术属于多肽纯化领域，具体是涉及一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法。
技术介绍
多肽是由20种氨基酸以不同的组成和排列方式通过肽键(酰胺键)相互连接而成的化合物，除了是组成蛋白质的基本结构单元，同时也是生物体内的重要活性物质，在生物界中分布较为广泛。在生命活动当中，涉及到各种毒素、激素、抗菌肽、信息素、细胞因子等生物活性多肽广泛参与分子识别信号传导、酶活调节、免疫调节以及细胞分化等过程；生物活性多肽的开发和利用越来越受到科学家的重视，在医药、食品、化妆品等行业中的应用日益广泛，尤其是医药行业当中，已经有大量的生物活性多肽通过了临床试验并投放市场，如降血糖的艾塞那肽、治疗乙型肝炎的胸腺肽、咖啡肽等等。糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血压为特征的代谢紊乱，高血压主要由胰岛素分泌或作用的缺陷引起。糖尿病可分两种，胰岛素依赖型糖尿病(I型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(II型糖尿病)，其中II型糖尿病患者占90％以上。WHO统计结果显示，目前全球已经诊断的II型糖尿病达到1.3亿人，我国已超过4000万人，是继印度之后的第二大糖尿病大国。常用的II型糖尿病治疗药物包括：双胍类、磺脲类、α-葡萄糖甘酶抑制剂、噻唑烷二酮类及胰岛素等。但研究发现，这几类常用药物都有可能造成身体的不良反应，特别是二甲双胍，有导致患者乳性酸酸中毒的危险性，而胰岛素治疗也常导致低血糖的发生。因此迫切需要研制出新的II型糖尿病治疗药物。研究表明，艾塞那肽是一种由39个氨基酸组成的多肽，Exendin-4(H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2)其结构与人的胰高血糖素有48％的同源性，与人的GLP-1(胰高血糖素样肽-1)有53％的同源性。Exendin-4能够与GLP-1受体作用，通过刺激胰岛β细胞再生，促进胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的释放，减慢胃排空速率，抑制食物摄入。其促进胰岛素分泌作用是根据血糖水平进行的，故可降低低血糖的发生率，且对其他促胰岛素分泌剂不敏感的II型糖尿病病人仍有降糖作用，同时GLP-1还可以减轻II型糖尿病患者的体重，是一类全新的糖尿病治疗药物。2005年4月，美国礼来公司和艾米啉(Amylin)公司共同开发的糖尿病药物倍它(Byetta)，化学名艾塞那肽(人工合成的Exendin-4)获美国FDA批准上市。与此同时，国外许多制药公司如诺和诺德制药公司、默克制药公司也在争相研发与倍它属于同类型的药物。但国内外对Exendin-4进行合成和纯化的相关文献都较少，尤其是艾塞那肽纯化方向，因此研究艾塞那肽现有纯化技术的改进和发展还有很长的路要走，摸索出一种操作更为简单成本较少的纯化方法很是重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法。本专利技术需要解决的技术问题是：现有纯化艾塞那肽体系中，一般采取的方式是先进行离子交换，但经离子交换后的样品中含有大量盐分，盐分在后续纯化过程中遇到有机溶剂浓度高的时候会在色谱柱中析出，从而影响后续纯化的分离效果，虽然可以通过在进行梯度洗脱之前用较高的水相去冲洗其中的盐分，但其操作时间过长，且不能较准确的控制时间，使整个纯化过程时间延长，效率降低。本专利技术的可以通过以下技术方案实现：一种醋酸艾塞那肽的分离纯化的方法，包括如下步骤：1、粗肽的预处理先将醋酸艾塞那肽粗肽进行自然晾干，使其切割过程中残留的溶剂挥发，晾干后将粗品溶解后利用高效液相色谱仪进行粗品分析，根据粗肽的分析图谱可以知道艾塞那肽的出峰浓度以及杂质的分布情况；2、溶样按照固液比1g艾塞那肽粗肽：18mL去离子水：2mL乙腈，将经过自然晾干的艾塞那肽粗肽超声溶解，超声时间为5-10min，溶解完全后用滤膜进行过滤，收集滤液；3、粗纯利用反向液相色谱法对滤液进行粗纯，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A1为体积分数为0.05％-0.2％的磷酸水溶液，流动相B1为体积分数为0.05％-0.2％磷酸的乙腈溶液进行梯度洗脱，分段收集粗纯后的埃塞那肽溶液取小样进行分析，将其中纯度大于90％部分的溶液收集待用；4、离子交换将步骤3中粗纯后收集的溶液进行离子交换，色谱柱填料为SP高流速琼脂糖微球的强阳离子交换柱，流动相A2为0.02mol/L的醋酸-醋酸钠水溶液，pH值为3.5～4.4，流动相B2为含有0.5mol/L氯化钠和0.02mol/L的醋酸-醋酸钠水溶液，pH值为3.5～4.4，进行梯度洗脱分段收集，取小样进行分析，将其中纯度大于95％部分的溶液收集待用；5、换盐将步骤4得到的溶液用反相高效液相色谱法进行换盐，流动相A3为0.5mol/L的醋酸铵水溶液，pH是3.8-4.8，流动相A4为体积分数为0.2％的醋酸水溶液，流动相B3为乙腈，进行梯度洗脱分段收集，取小样进行分析，将其中纯度大于98％部分的溶液收集待用；6、冻干将步骤5中得到的纯度达到98％以上部分的溶液收集起来进行浓缩，浓缩后得到的浓缩液进行冻干。进一步的，步骤1中粗肽分析的流动相A为体积分数为0.1％的磷酸水溶液，流动相B为体积分数为0.1％的磷酸乙腈溶液，分析时间为20分钟，流动性相A的梯度是5-95，流动相B的梯度是95-5，分析所用仪器为北京创新通恒LC3000Ⅰ型。进一步的，步骤2中过滤的滤膜为0.45um的水系滤膜。进一步的，步骤3中粗纯的时间为0-40分钟，洗脱梯度是流动相A相20-50，流动相B相80-50。进一步的，步骤4中的离子交换的洗脱梯度为0-40分钟，流动相A相为30-70，流动相B相为70-30。进一步的，步骤5中色谱柱填料是十八烷基硅烷键合硅胶，梯度洗脱时间为60分钟，前30分钟A3:B3按95：5的梯度进行等度洗脱，后30分钟流动相A4为20-50，流动相B3相为80-50进行梯度洗脱。进一步的，步骤6中进行浓缩使用的是旋转蒸发仪，减压浓缩至5-8g/L后转至冻干盘中冻干，冻干机使用的是原位冷冻干燥机VFD-2000A。本专利技术的有益效果：1、通过在纯化之前进行粗肽分析使得纯化过程有了一定的导向性，对目标物的出峰浓度及杂质分布的位置有了预判，使得后续收集目标物的过程更有目的性。2、为了避免离子交换过程中产生的盐分对后续纯化过程的影响，先进行了粗品的提纯再进行离子交换之后再换盐，对后续纯化影响较小，且在换盐过程中的用醋酸铵等度洗脱的过程相当于一个冲洗盐分的过程，减少了时间。3、此实验过程中使用的色谱柱类型为普通十八烷基硅烷键合硅胶柱和强阳离子交换柱未涉及到GEL反向聚合物柱，所用试剂均为常用试剂，节约了成本且实验本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)粗肽的预处理/n先将艾塞那肽粗肽进行自然晾干，使其切割过程中残留的溶剂挥发，晾干后将粗粗肽溶解后利用高效液相色谱仪进行粗肽分析，根据粗肽的分析图谱可以知道艾塞那肽的出峰浓度以及杂质的分布情况；/n(2)溶样/n按照固液比1g艾塞那肽粗肽：18mL去离子水：2mL乙腈将经过自然晾干的艾塞那肽粗肽超声溶解，超声时间为5-10min，溶解完全后用滤膜进行过滤，收集滤液；/n(3)粗纯/n利用反向液相色谱法对滤液进行粗纯，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A1是体积分数0.05％-0.2％的磷酸水溶液，流动相B1是体积分数0.05％-0.2％磷酸的乙腈溶液进行梯度洗脱，分段收集粗纯后的艾塞那肽溶液取小样进行分析，将其中纯度大于90％的一段溶液收集待用；/n(4)离子交换/n将步骤(3)中粗纯后收集的溶液进行离子交换，填料为SP高流速琼脂糖微球的强阳离子交换柱，流动相A2为0.02mol/L pH值为3.5～4.4的醋酸-醋酸钠水溶液，流动相B2为含有0.5mol/L氯化钠的0.02mol/L pH值为3.5～4.4的醋酸-醋酸钠水溶液进行梯度洗脱，分段收集粗纯后的艾塞那肽溶液取小样进行分析，将其中纯度大于95％的一段溶液收集待用；/n(5)换盐/n将步骤(4)得到的溶液用反相高效液相色谱法进行换盐，流动相A3为0.5mol/L的醋酸铵水溶液pH为3.8-4.8，流动相A是体积分数0.2％的醋酸水溶液，流动相B3为纯乙腈，进行梯度洗脱，分段收集粗纯后的艾塞那肽溶液取小样进行分析，将其中纯度大于98％的一段溶液收集待用；/n(6)冻干/n将步骤(5)中得到的纯度达到98％以上部分的溶液收集起来进行浓缩，浓缩后得到的浓缩液进行冻干。/n...

【技术特征摘要】
1.一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)粗肽的预处理
先将艾塞那肽粗肽进行自然晾干，使其切割过程中残留的溶剂挥发，晾干后将粗粗肽溶解后利用高效液相色谱仪进行粗肽分析，根据粗肽的分析图谱可以知道艾塞那肽的出峰浓度以及杂质的分布情况；
(2)溶样
按照固液比1g艾塞那肽粗肽：18mL去离子水：2mL乙腈将经过自然晾干的艾塞那肽粗肽超声溶解，超声时间为5-10min，溶解完全后用滤膜进行过滤，收集滤液；
(3)粗纯
利用反向液相色谱法对滤液进行粗纯，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A1是体积分数0.05％-0.2％的磷酸水溶液，流动相B1是体积分数0.05％-0.2％磷酸的乙腈溶液进行梯度洗脱，分段收集粗纯后的艾塞那肽溶液取小样进行分析，将其中纯度大于90％的一段溶液收集待用；
(4)离子交换
将步骤(3)中粗纯后收集的溶液进行离子交换，填料为SP高流速琼脂糖微球的强阳离子交换柱，流动相A2为0.02mol/LpH值为3.5～4.4的醋酸-醋酸钠水溶液，流动相B2为含有0.5mol/L氯化钠的0.02mol/LpH值为3.5～4.4的醋酸-醋酸钠水溶液进行梯度洗脱，分段收集粗纯后的艾塞那肽溶液取小样进行分析，将其中纯度大于95％的一段溶液收集待用；
(5)换盐
将步骤(4)得到的溶液用反相高效液相色谱法进行换盐，流动相A3为0.5mol/L的醋酸铵水溶液pH为3.8-4.8，流动相A是体积分数0.2％的醋酸水溶液，流动相B3为纯乙腈，进行梯度洗脱，分段收集粗纯后的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李荣光，
申请(专利权)人：李荣光，
类型：发明
国别省市：安徽;34