一种能够抑制趋化性细胞因子受体CXCR4启动子活性的药物制造技术

本发明专利技术一种抑制癌细胞的药物，具体涉及一种能够抑制趋化性细胞因子受体CXCR4启动子活性的药物，包括穿心莲内酯以及进行的对比实验，本发明专利技术不仅你能够显著抑制CXCR4启动子活性，而且能够为抗HIV研究提供新的途径，本发明专利技术的另一目的是提供了筛选抑制CXCR4启动子活性的药物筛选系统，本发明专利技术构建了双荧光素酶报告基因技术，以萤火虫荧光素酶作为报告基因，用于反映CXCR4启动子的活性。

【技术实现步骤摘要】
一种能够抑制趋化性细胞因子受体CXCR4启动子活性的药物
本专利技术一种抑制癌细胞的药物，具体涉及一种能够抑制趋化性细胞因子受体CXCR4启动子活性的药物。
技术介绍
获得性免疫缺陷综合症(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的传染性疾病，HIV-1进入靶细胞与CD4结合后，gp120通过构象变化从而暴露其辅助受体CXCR4的结合位点，形成CD4-gp120-CXCR4三分子复合物，导致病毒和靶细胞之间的膜融合，允许病毒RNA基因组进入靶细胞，作为G蛋白偶联因子超家族成员的细胞膜蛋白CXCR4是参与HIV感染人体感染的主要辅助受体,CXCR4启动T细胞嗜性(T-tropic)的HIV-1病毒株感染宿主细胞，因此，可以通过干预CXCR4的启动子,影响CXCR4基因的表达来预防和治疗HIV感染；穿心莲，属于多年生草本植物，以全草入药，在我国民间有悠久的药用史，主要功效为消炎与清热解毒，穿心莲的活性成分包括：二萜内酯化合物、黄酮类和甾醇等物质，其中穿心莲内酯已被开发成多种消炎制剂，穿心莲内酯的分子结构可以做为抗HIV新药设计的结构基础，具有开发潜力，利用构建的药物筛选系统pGL4.10-RLUC，筛选出穿心莲内酯能够显著抑制CXCR4启动子活性。
技术实现思路
为克服现有技术存在的不足，本专利技术提供了一种能够抑制趋化性细胞因子受体CXCR4启动子活性的药物。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种能够抑制趋化性细胞因子受体CXCR4启动子活性的药物，包括穿心莲内酯，所述穿心莲内酯为：制作母液，所述母液为穿心莲内酯和无水乙醇配制而成。由293T细胞制作成的多组培养，并在不同的培养基中加入不同浓度的母液；在加入穿心莲内酯24h后进行CCK8比色实验，根据CCK8检测结果把293T细胞分为7组进行对比实验。构建的药物筛选系统pGL4.10-RLUC，在转染前1d以每孔3.6×105个细胞接种于6孔板,置于体积分数10％胎牛血清(FBS)细胞培养基，5％CO2、37℃常规培养；在细胞融合率达到80％-90％时，用脂质体包裹转染质pGL4.10-RLUC入293T细胞中，在转染6小时后，更换体积分数10％胎牛血清(FBS)细胞培养基，用实验分组的穿心莲内酯作用于已转染pGL4.10-RLUC的293T细胞，并5％CO2、37℃常规培养24h后，收集六孔板里的细胞，然后进行对照。本专利技术的有益效果在于：本专利技术不仅你能够显著抑制CXCR4启动子活性，而且能够为抗HIV研究提供新的途径，本专利技术的另一目的是提供了筛选抑制CXCR4启动子活性的药物筛选系统，本专利技术构建了双荧光素酶报告基因技术，以萤火虫荧光素酶作为报告基因，用于反映CXCR4启动子的活性。附图说明图1为本专利技术的Rluc表达单元；图2为本专利技术的为CXCR4酶切产物电泳图；图3为本专利技术的穿心莲内酯对荧光素酶表达的影响。具体实施方式一种能够抑制趋化性细胞因子受体CXCR4启动子活性的药物，包括穿心莲内酯，所述穿心莲内酯为：优选的，本专利技术选用的穿心莲内酯来源于Sigma-Aldrich公司,货号与规格:365645-100MG,HPLC≥98％。制作母液，用穿心莲内酯和无水乙醇配制成10μmol/L母液。由293T细胞制作成的多组培养，并在不同的培养基中加入不同浓度的母液；在加入穿心莲内酯24h后进行CCK8比色实验，根据CCK8检测结果把293T细胞分为7组进行对比实验。构建的药物筛选系统pGL4.10-RLUC，在转染前1d以每孔3.6×105个细胞接种于6孔板,置于体积分数10％胎牛血清(FBS)细胞培养基，5％CO2、37℃常规培养；在细胞融合率达到80％-90％时，用脂质体包裹转染质pGL4.10-RLUC入293T细胞中，在转染6小时后，更换体积分数10％胎牛血清(FBS)细胞培养基，用实验分组的穿心莲内酯作用于已转染pGL4.10-RLUC的293T细胞，并5％CO2、37℃常规培养24h后，收集六孔板里的细胞，然后进行对照。具体实验操作步骤如下：制作细胞悬液：细胞培养至对数生长期时进行实验，制备成约5×104个/L的细胞悬液，每孔加入100μL细胞悬液接种于96孔板中，24h后加入含不同浓度穿心莲内脂(10、20、40、60、80μmol/L)完全培养基(每孔设3个复孔)；加入不同浓度的穿心莲内脂24h后进行CCK8比色实验。CCK8比色实验：在每次比色前1h，每孔加入CCK8溶液10μL，继续培养1h后，在450nm处进行吸光度A测定，此实验重复3次。计算各实验组抑制率＝[(对照组-实验孔)/(对照孔-空白孔)]×100％。根据CCK8检测结果把293T细胞分为7组:A:空白组(Control)为不转染pGL4.10-RLUC的293T空细胞、B:对照组(Abs)给予穿心莲内酯组最高剂量(80μmol/L)中所含溶剂无水乙醇的量、C:穿心莲内酯组(10μmol/L穿心莲内酯)、D:穿心莲内酯组(20μmol/L穿心莲内酯)、E:穿心莲内酯组(40μmol/L穿心莲内酯)、F:穿心莲内酯组(60μmol/L穿心莲内酯)、G:穿心莲内酯组(80μmol/L穿心莲内酯)；转染步骤参照脂质体LipofectamineTM2000转染说明进行瞬时转染，在转染前1d以每孔3.6×105个细胞接种于6孔板,置于体积分数10％胎牛血清(FBS)细胞培养基，5％CO2、37℃常规培养；在细胞融合率达到80％-90％时，用脂质体包裹转染质pGL4.10-RLUC入293T细胞中，在转染6小时后，更换体积分数10％胎牛血清(FBS)细胞培养基。用实验分组的穿心莲内酯作用于已转染pGL4.10-RLUC的293T细胞，在5％CO2、37℃常规培养24h后，收集六孔板里的细胞，按照Promega公司双荧光素酶报告基因试剂盒说明书步骤操作，用Glomex20/20检测仪分别检测各组细胞的海肾荧光素酶和萤火虫萤光素酶荧光值，每个药物浓度设置3个复孔；在进行对比时，以下游重组入海肾荧光素酶(hRLUC)基因，作为本底对照报告基因；由于hRluc单元具有增强子SV40，使hRLUC基因表达活性较强，使得双荧光素酶报告基因载体不能真实反映出上游启动子的活性。因此，本实验通过PCR技术，扩增出了保留hRluc单元中SV40部分片段的基因片段(命名该基因片段为Rluc)，将CXCR4启动子基因片段和Rluc插入含有Firely荧光素酶报告基因的PGL4.10表达载体上，形成重组质粒pGL4.10-Rluc-CXCR4，降低了SV40活性，减少本底表达，提高了双荧光素酶报告基因技术的灵敏性和准确性，将重组载体瞬时转染入293T细胞中，不同浓度的穿心莲内酯对HIV辅助受体CXCR4启动子活性的影响，通过海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶活性的比值表达出来，通过分析CXCR4启动子的活性，可以得出中药穿心莲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够抑制趋化性细胞因子受体CXCR4启动子活性的药物，包括穿心莲内酯，/n所述穿心莲内酯为：/n

【技术特征摘要】
1.一种能够抑制趋化性细胞因子受体CXCR4启动子活性的药物，包括穿心莲内酯，
所述穿心莲内酯为：

。


2.根据权利要求1所述的一种能够抑制趋化性细胞因子受体CXCR4启动子活性的药物，制作母液，所述母液为穿心莲内酯和无水乙醇配制而成。


3.根据权利要求2所述的一种能够抑制趋化性细胞因子受体CXCR4启动子活性的药物，由293T细胞制作成的多组培养，并在不同的培养基中加入不同浓度的母液；在加入穿心莲内酯24h后进行CCK8比色实验，根据CCK8检测结果把293T细胞分为7组进行对比实验。

【专利技术属性】
技术研发人员：冯龙，冯书营，韩倩倩，马云云，张文娴，史占江，李志慧，郑文锦，耿宇轩，
申请(专利权)人：河南中医药大学，
类型：发明
国别省市：河南;41