一种炭角菌科真菌sj18及其在松材线虫防治上的应用制造技术

一种炭角菌科真菌sj18及其在松材线虫防治上的应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种炭角菌科真菌sj18及其次生代谢产物在控制松材线虫上的作用。本发明专利技术的炭角菌科真菌sj18及其次生代谢产物源于自然归于自然、与环境友好兼容、无污染无残留，对松材线虫有高效的抑制作用，可作为无公害新型生物农药，用于松材线虫感染引起的松树萎蔫病的无害化防治。松材线虫感染引起的松树萎蔫病的无害化防治。松材线虫感染引起的松树萎蔫病的无害化防治。

【技术实现步骤摘要】
一种炭角菌科真菌sj18及其在松材线虫防治上的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及炭角菌科真菌sj18在松材线虫防治上的应用。

技术介绍

[0002]松材线虫病是由松树感染寄生虫——松材线虫引起松树萎蔫死亡的一种国际重大检疫性病害。1982年我国首次在南京市紫金山黑松上发现松材线虫病，死树265株，到2017年，35年时间内松材线虫病先后在18个省的300多个市县发生。在我国松材线虫病是一种典型的病原主导性病害，即病害的发生取决于有没有病原的感染，一旦感病，其结果就是死亡，因此，被称为松树的“癌症”。我国全国松林面积有5亿多亩，三十多年来的观察发现，我国所有乡土松树如马尾松、黑松、赤松、琉球松、华山松、云南松、思茅松、黄山松、华山松、红松等都是易感病树种。事实上，目前松材线虫病已经成了我国的头号森林病虫害。松材线虫病是一种相对比较复杂的病害，它由媒介昆虫-松墨天牛传播，所以这个病害既涉及到病，又涉及到虫，非常复杂。目前，防治媒介昆虫主要有以下几种做法：一是喷洒化学药剂；二是用引诱剂引诱媒介天牛；三是生物防治。在自然界中喷洒化学药剂，要求每隔几天大面积喷洒一次药剂，这个办法经济成本很高。引诱剂防治存在的问题是，无法回答防治后林间还有多少天牛数量，因此显然也不能把它做为松材线虫病防控的主要手段。生物防治措施方面当前主要有两个，一个是真菌—球孢白僵菌：寄生天牛幼虫使其死亡；第二个是天敌昆虫—管氏肿腿蜂、花绒寄甲：可寄生天牛幼虫使其死亡；但这些方法在林间的影响因素很多，防治效果很不稳定，也不确定。在控制松材线虫病方面，生产上用的比较多的是用生物杀线剂阿维菌素、甲维盐等进行树干注射，注药一次能防2-3年。但是这种树干注射剂价格高，注射全程由人工完成，因此仍然成本较高，通常只能应用在重要区域或古树名木上。全国大面积的松树，特别是马尾松，亿万年来随着进化的发展适应于我国的气候环境，是我国的乡土树种，也是造林先锋树种，具有很多的优点，不能把它彻底放弃掉。目前，我们国家也开始做马尾松抗松材线虫病的抗性育种，但这是一条长期的道路，无法在短期内实现。
[0003]利用真菌侵染使松木获得松材线虫病的抗性，这是一个值得尝试的新方法。事实上，这个方法已经在菌根的研究中有所证实，如中华美牛肝菌、黄豹斑鹅膏和彩色豆马勃等真菌，在接种到马尾松和黑松上后能够延缓或减轻其苗木的死亡。但是，目前尚未发掘出在驱虫和熏蒸方面有足够效力的侵染真菌，多年来这方面的进展不大，也未引起足够的重视。本专利技术即从这个角度，在筛选出具有驱虫和熏蒸等多重作用的炭团菌属真菌sj18（已授权专利技术201710795984.0）的基础上，进一步挖掘其作为松材线虫的生物农药功能。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的问题，本专利技术在原有专利技术“一种炭角菌科真菌及其应用”（专利号201710795984.0）的基础上，开发出一种利用该菌杀灭松材线虫的技术方案；所述的一种炭角菌科真菌（Xylaria radix）sj18，其保藏号为CGMCC No.12780；
所述的炭角菌科真菌及其粗提取物作为松材线虫杀灭剂的应用；本专利技术的炭角菌科真菌源于自然归于自然、与环境友好兼容、无污染无残留，对松材线虫有独特的控制作用，可作为无公害新型农药。
[0005]附图说明
[0006]图1为sj18菌在显微镜下的形态；图2为不同浓度的甲维盐下线虫死亡率随时间变化的曲线图；图3为不同浓度的sj18的PDB培养发酵液上清液下线虫死亡率随时间变化的曲线图；图4为不同浓度的sj18的大麦发酵液上清液下线虫死亡率随时间变化的曲线图；图5为不同浓度的sj18菌的70℃水抽提物下线虫死亡率随时间变化的曲线图；图6为不同浓度的sj18菌的70℃水抽提物加甲维盐下线虫死亡率随时间变化的曲线图；图7为不同浓度的sj18菌的100℃水抽提物下线虫死亡率随时间变化的曲线图；图8为不同浓度的sj18大麦发酵液70℃恒温30min后的上清液下线虫死亡率随时间变化的曲线图；图9为纯水对照。
[0007]具体实施方式
[0008]以下结合实施例来进一步说明本专利技术。下述的实施例并不对本专利技术作限定作用。
[0009]实施例1：炭角菌科真菌的分离从一株野生山核桃林木的根部取材，洗净，切成2cm左右小段，先经70%酒精表面消毒，再用50%安替福民（次氯酸钠溶液）浸泡消毒半小时，最后无菌水浸泡冲洗4-5次；将消毒好的材料在超净台上切开，接种到PDA培养基（固体土豆培养基）平板上培养，待有菌长出时，分别划线纯化，并分别提取DNA进行分子鉴定，从而获得并确认该菌株。确认该菌株的具体步骤如下：1）从PDA平板上挑取待测菌加入至悬浮溶液A中，在菌液中加入经灭菌后的直径3-5mm碳化钨圆珠1颗，置于沸水浴中5min后，在液氮速冻下，用往复式粉碎机研磨，研磨粉碎后，待恢复至常温；2）准备高吸附力的柱子：取带过滤柱的离心管，加入吸附剂悬液S，离心处理，使吸附剂在过滤柱中形成斜面，舍弃滤液；3）菌裂解和核酸吸附：加入裂解液L到步骤1）处理后的菌液中，上下剧烈震荡，静置，离心，再取上清加入到步骤2）制好的吸附柱中，室温放置，离心，舍弃滤液，收集管重新放回；4）清洗：取步骤3）得到的上清液加入清洗液W，离心，清洗，每次倒掉收集管的滤液，最后一次离心15s后，吸附柱不再放回收集管；5）洗脱：将吸附柱转移到新离心管中，滴上10-15μL洗脱液E，盖紧盖子，保持60℃、5-10min，离心，收集到的滤液即为提取到的微量核酸溶液；6）ITS序列的PCR扩增：取步骤5）得到的微量核酸溶液为模板，以引物ITS4（5
’-
TCCTCCGCTTATTGATATGC-3
’
）和ITS5（5
’-
GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG-3
’
）进行PCR扩增，PCR反应体积是60μL，10X Taq Buffer 6μL, 2.5 mM 的dNTP mixture 5μL, Taq 3u, 10μM的引物各2.5μL，模板体积为6μL，剩余用纯水补足；PCR反应程序为：95
°
C 300s；94℃ 15s，52
°
C 45s，72
°
C 45s，共35-40轮循环；72℃ 300s。其扩增产物约600bp，该产物以常规PCR产物切胶纯化方法纯化后，最后以ITS4为测序引物，测得其ITS序列为：TTCTAGCTGAGCTGAGGTCACCTCTAGAATATATAGGGGTTTAACGGCTACCAGCCAGGGCCACCACACGAGCGAGAGAGATTACTACGCTGAGAGTGTACCCTAACTCCGCCACTAACTTTGAGGAACTACGCCGTAGATTCCCAACGCTAAGCAACAAGGGCTTAAGGGTCGAAATGACGCTCGAATAGGCATGCCCACTATAATACTAATGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCGCTGAATTCTGCA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.保藏号为CGMCC No.12780的炭角菌科真菌（Xylaria r...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭华正，朱汤军，金群英，张飞英，叶华琳，
申请(专利权)人：浙江省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：