一种维生素B12的精制方法及所得产品的应用技术

本发明专利技术公开了一种维生素B12的精制方法。本发明专利技术所述的维生素B12的精制方法：将维生素B12粗品与有机溶剂混合，降温至0～5℃，然后加入还原剂，在室温下搅拌1～2小时，过滤，在40～60℃下真空干燥，得到精制后的维生素B12纯品，所述的维生素B12纯品的纯度大于99％。本发明专利技术创造性的使用维生素B12作为BNCT类药物辅助药物，通过协同使用使得BNCT类药物在肿瘤细胞内的富集作用更加明显，同时维生素B12还有细胞保护，提高机体免疫力等功效。提高机体免疫力等功效。提高机体免疫力等功效。

【技术实现步骤摘要】
一种维生素B12的精制方法及所得产品的应用


[0001]本专利技术涉及化学
，具体涉及一种维生素B12的精制方法，以及该方法所得产品的应用。

技术介绍

[0002]维生素B12又叫钴胺素，是一种含有3价钴的多环系化合物，4个还原的吡咯环连在一起变成为1个咕啉大环(与卟啉相似)，是唯一含金属元素的维生素。维生素B12为红色结晶粉末，无嗅无味，微溶于水和乙醇，在pH值4.5～5.0弱酸条件下最稳定，强酸(pH<2)或碱性溶液中分解，遇热可有一定程度破坏。高等动植物不能制造维生素B12，自然界中的维生素B12都是微生物合成的。维生素B12是唯一的一种需要一种肠道分泌物(内源因子)帮助才能被吸收的维生素，参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血，防止大脑神经受到破坏。其生理作用包括如下：已知B12是几种变位酶的辅酶，如催化Glu转变为甲基Asp的甲基天冬氨酸变位酶、催化甲基丙二酰CoA转变为琥珀酰CoA的的甲基丙二酰CoA变位酶。B12辅酶也参与甲基及其他一碳单位的转移反应。B12主要存在于肉类中，植物中的大豆以及一些草药也含有B12，肠道细菌可以合成，故一般情况下不缺乏，但B12是消化道疾病者容易缺乏的维生素，也是红血球生成不可缺少的重要元素，如果严重缺乏，将导致恶性贫血。维生素B12广泛存在于动物食品中。而且其形态无法被人体吸收。此外，维生素B12也是唯一含必须矿物质的维生素，因含钴而呈红色，又称红色维生素，是少数有色的维生素。维生素B12虽属B群维生素，却能贮藏在肝脏，用尽贮藏量后，经过半年以上才会出现缺乏症状。人体维生素B12需要量极少，只要饮食正常，就不会缺乏。少数吸收不良的人须特别注意。
[0003]硼中子俘获疗法(Boron Neutron Capture Therapy)简称BNCT，即应用于热中子照射靶向聚集在肿瘤或癌症部位的硼，硼俘获中子后产生重粒子α粒子(氦原子核)和高能Li核，进而选择性的杀灭肿瘤和癌症细胞。
[0004]维生素B12作为BNCT类药物辅助药物未见文献报道，如果能够合理的使用，将是很大的突破。同时，由于粗品维生素B12由于制备工艺复杂所以杂质非常多，无法直接应用，所以需要对其精制方法进行研究。

技术实现思路

[0005]专利技术目的，针对现有技术中的不足之处，本专利技术提供了一种维生素B12的精制方法，通过该方法得到的纯品维生素B12可以作为BNCT类药物辅助药物。增强了硼离子在肿瘤细胞内的高浓度富集作用效果。
[0006]技术方案：本专利技术所述的维生素B12的精制方法：将维生素B12粗品与有机溶剂混合，降温至0～5℃，然后加入还原剂，在室温下搅拌1～2小时，过滤，在40～60℃下真空干燥，得到精制后的维生素B12纯品，所述的维生素B12纯品的纯度大于99％。
[0007]具体的，所述的有机溶剂为：甲醇、乙醇。
[0008]具体的，所述的还原剂为氰基硼氢化钠。
722.6984387012280.3100.310 824.200148384520.1050.105 总计 141629341443537100.000
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[0034]实施例4
[0035]本专利技术所述邻碳硼烷衍生物以及添加维生素B12后在体外细胞活性的测试结果。
[0036]所述的邻碳硼烷衍生物结构如下：
[0037][0038]对于化合物相关性能指标的测定均为本领域常规通用方法。
[0039]1、IC50的测定
[0040]在不同样品浓度下，给药48h后，通过通用的MTT法检测化合物对结肠肿瘤细胞CT26生长抑制情况，最后计算出IC50，以抑制细胞存活所需的药物浓度从半数致死量确定，并且结果代表平均值
±
。。
[0041]MTT为四甲基偶氮唑盐，是一种能接受氢离子的黄色染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase)和细胞色素C(cytochromeC)，可使MTT生成蓝紫色的甲瓒(formazan)结晶而析出沉淀，而死细胞无此功能。将生成的甲瓒结晶溶于二甲基亚砜(DMSO)后，可通过酶联免疫检测仪测定490nM或570nM处溶液的吸光值，来监测甲瓒的生成量。而甲瓒结晶的生成量与活细胞数成正比，故可以检测药物对细胞活力的影响。该方法因灵敏度高、经济等特点，广泛用于抗肿瘤药物筛选测试中。
[0042]具体的实验方法是：各种细胞离心后配成5
×
103个/mL的细胞悬液，在96孔板中每孔加入100μL细胞悬液,常规培养24h后，吸去原培养液，加入200μL配置好的化合物I,II或硼苯丙氨酸(BPA)样品，化合物I与维生素B12以及化合物II与维生素B12，各样品的最终浓度分为0.137μM、0.046μM、1.235μM、0.412μM、3.704μM共5个浓度，每个浓度做4个复孔，96孔板四周的孔用PBS封孔，并留出阴性对照组和空白对照组，化合物作用72h后，每孔加入MTT溶液20μL，继续培养4h，小心吸弃孔内培养基，加入DMSO150μL震荡10min，在酶标仪490nM处测定各孔的OD值，按下式计算样品在不同浓度下的抑制率：抑制率＝(对照孔OD值－给药孔OD值)/对照孔OD值
×
100％。最后应用相关软件计算样品的IC50值。
[0043]操作方法：
[0044](1)结肠肿瘤CT26细胞(5
×
105个细胞)在96多孔板中进行有氧和无氧培养。有氧培养条件为36.5～37℃状态下，提供无菌去离子氧，供氧速度为每分钟/0.3cm2，且充分给于时间在12小时。无氧培养条件为36.5～37℃状态下，无菌无氧密封干燥箱条件，且充分给于时间在12小时。
[0045](2)邻碳硼烷化合物I,II，化合物I与维生素B12，化合物II与维生素B12和硼苯丙氨酸(BPA)依次在(3mM to 1mM)下72小时进行处理。
[0046](3)依次加入3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐溶液，培养4小时。
[0047](4)在用二甲亚砜150μL稀释震荡。
[0048](5)通过酶联免疫检测仪测定蛋白质含量595nm测试。
[0049]2、硼吸收
[0050]p-35细胞(5
×
103细胞)在化合物I,II和硼苯丙氨酸(BPA)(统一硼浓度为10.8ppm)的存在下处理3小时。3滴磷酸缓冲盐溶液洗涤三次后；
[0051](4)高氯酸/过氧酸进行分析。
[0052](5)70℃下进行有氧和无氧培养。有氧培养条件为36.5～37℃状态下，提供无菌去离子氧，供养速度为每分钟/0.3cm2，且充分给于时间在12小时。无氧培养条件为36.5～37℃状态下，无菌无氧密封干燥箱条件，且充分给于时间在12小时。
[0053](6)等离子体发射光谱法测试。
[0054]操作方法：
[0055](1)结肠肿瘤CT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种维生素B12的精制方法，其特征在于，将维生素B12粗品与有机溶剂混合，降温至0～5℃，然后加入还原剂，在室温下搅拌1～2小时，过滤，在40～60℃下真空干燥，得到精制后的维生素B12纯品，所述的维生素B12纯品的纯度大于99％。2.根据权利要求1所述的维生素B12的精制方法，其特征在于，所述的有机溶剂为：甲醇、乙醇。3.根据权利要求1所述的维生素B12的精制方法，其特征在于，所述的还原剂为氰基硼氢化钠。4.根据权利要求1所述的维生素B12的精制方法，其特征在于，所述还原剂的加入量为粗品维生素B12质量的10％～15％。5.权利要求1所述的维生素B...

【专利技术属性】
技术研发人员：张红夺，金峰，金涛，王雯，金成福，李仙洛，
申请(专利权)人：南京艾斯特医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：