本发明专利技术公开了一种C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的铁蛋白纳米粒子、其制备方法及应用。C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的铁蛋白纳米粒子，通过连接序列将肿瘤穿透肽RGERPPR与铁蛋白C末端连接，肿瘤穿透肽RGERPPR暴露于铁蛋白的外部。本发明专利技术C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的铁蛋白纳米粒子，具有较强的靶向能力和细胞穿透力，能够与肿瘤细胞有很强的结合，所制得的抗肿瘤药物有着很强的细胞毒性，为后续药物靶向肿瘤细胞治疗提供了非常好的载体模型，具有很好的应用前景。好的应用前景。好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的铁蛋白纳米粒子、其制备方法及应用
[0001]本专利技术涉及一种C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的铁蛋白纳米粒子、其制备方法及应用，属于抗肿瘤
技术介绍
[0002]蛋白质笼具有良好的稳定性、生物相容性和生物降解性，已广泛应用于药物传递和疫苗开发。其中，铁蛋白是由24个蛋白亚基自组装形成纳米中空笼状结构，该纳米笼水溶性好、生物相容性强，体内稳定性佳，尺寸均一，且该铁蛋白本身具有靶向性，可与肿瘤细胞中过量表达的转铁蛋白受体1(TfR1)特异性结合。虽然铁蛋白固有的肿瘤靶向能力使其成为一种简单的药物传递载体，但它并不局限于仅靶向于天然受体TfR1，而且可以随时修改附加的靶向基元，用于多种用途。
[0003]有大量研究表明，肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞表面的神经纤毛蛋白1(Neuropilin-1， NRP-1)表达量过高，利用NRP-1作为靶标介导纳米递药系统对肿瘤进行靶向治疗已经被开展。表面修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的纳米粒子，能够与肿瘤细胞过量表达的NRP-1 特异性结合，还可与其肿瘤新生血管过量表达的NRP-1特异性结合，在NRP-1的介导下进入细胞，增强细胞对铁蛋白纳米粒子的摄取，为药物的传递提供了良好的可行性。为了进一步提高靶向肿瘤细胞的能力，有必要研究开发在细胞穿透能力和细胞结合作用方面更强的新型纳米粒子。
技术实现思路
[0004]为解决现有的纳米粒子对肿瘤细胞的靶向能力不够强，效率不够高的缺陷，本专利技术提供一种C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的铁蛋白纳米粒子、其制备方法及应用，有望实现在靶向肿瘤细胞的同时，有效地递送至肿瘤新生血管并穿透血管实现对肿瘤细胞转铁蛋白受体1(TfR1)以及神经纤毛蛋白受体1(NRP-1)的双重靶向效果，为后续选择药物靶向肿瘤细胞治疗提供了非常好的模型，具有很好的应用前景。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0006]一种C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的铁蛋白纳米粒子，通过连接序列将肿瘤穿透肽RGERPPR与铁蛋白C末端连接，肿瘤穿透肽RGERPPR暴露于铁蛋白的外部。
[0007]本专利技术C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的铁蛋白为基于铁蛋白改造的融合蛋白。
[0008]RGERPPR表示一种肿瘤穿透肽。
[0009]在连接序列中加入MMP-2酶切位点或突变MMP-2酶切位点序列，分别得到 HFtn-MMP2-RGE和HFtn-mMMP2-RGE，其中，MMP2表示能够被MMP-2酶切的位点，序列为PLGLAG；mMMP2表示被突变的MMP-2酶切位点，突变后序列为ALGAAG； HFtn为由24个铁蛋白亚基组成的纳米蛋白笼。RGE为肿瘤穿透肽RGERPPR的缩写。 MMP-2酶是一种重组人基质金属蛋白酶2。
[0010]C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的含MMP-2酶切位点的铁蛋白编码基因为SEQ IDNo.1；C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的含突变MMP-2酶切位点的铁蛋白编码基因为 SEQ ID No.2；C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的编码蛋白为SEQ ID No.3。
[0011]上述铁蛋白为人重链铁蛋白。连接序列为人重链铁蛋白上的连接序列。
[0012]C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的铁蛋白纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
[0013](1)重组铁蛋白表达工程菌的构建：
[0014]以HFtn编码基因为基础，在其3'端通过连接序列将肿瘤穿透肽RGERPPR与铁蛋白 C末端连接，在连接序列中插入MMP-2酶切位点并克隆至质粒载体中，得到 HFtn-MMP2-RGE质粒；将连接序列中插入突变MMP-2酶切位点并克隆至质粒载体中，得到HFtn-mMMP2-RGE质粒；将两种质粒分别转化至大肠杆菌感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性单克隆转化子，以获得目的重组铁蛋白表达工程菌；
[0015](2)重组铁蛋白的表达纯化：
[0016]将表达目的重组铁蛋白表达工程菌以1
±
0.02％的接种比例接种于含有氨苄青霉素的培养基中，待菌液OD600值达到0.6-0.8时，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达，离心收集沉淀，然后超声破碎沉淀，离心收集上清，再将上清水浴加热，再次离心，通过体积排阻色谱(SEC)对目的重组铁蛋白进行多次纯化，得到目的重组铁蛋白 HFtn-MMP2-RGE和HFtn-mMMP2-RGE。
[0017]本申请％，没有特别说明的情况下，指体积百分比。
[0018]上述步骤(1)中，在连接序列中插入MMP-2酶切位点的编码基因为 GGTGGTGGTGGTAGCGGTCCGCTGGGTCTGGCAGGTGGTGGTGGTGGTAGCGGTGG TGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTAGCCGTGGTGAACGTCCGCCGCGT，将该基因序列亚克隆至pET-20b(+)质粒载体中，得到HFtn-MMP2-RGE质粒。所用的宿主菌为大肠杆菌；通过阳性单克隆筛选并在LB培养基中大量培养。
[0019]上述步骤(1)中，在连接序列中插入突变MMP-2酶切位点的编码基因为 GGTGGTGGTGGTAGCGGTGCACTGGGTGCAGCAGGTGGTGGTGGTGGTAGCGGTG GTGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTAGCCGTGGTGAACGTCCGCCGCGT，将该基因序列亚克隆至pET-20b(+)质粒载体中，得到HFtn-mMMP2-RGE质粒。所用的宿主菌为大肠杆菌；通过阳性单克隆筛选并在LB培养基中大量培养。
[0020]为了提高得率，上述步骤(2)中，IPTG的终浓度为0.5
±
0.02mM；步骤(2)中，将上清进行水浴加热，温度为60
±
5℃，时间为8～12min。
[0021]上述HFtn-MMP2-RGE用于验证肿瘤穿透肽RGERPPR暴露于铁蛋白的外部。
[0022]验证肿瘤穿透肽RGERPPR暴露于铁蛋白的外部的方法如下步骤：重组人MMP-2蛋白在1
±
0.02mM APMA(p-aminophenylmercuric acetate，对氨基苯汞乙酸盐)，37
±
2℃下激活55～65min，将梯度浓度下活化的MMP-2与HFtn-MMP2-RGE蛋白在TCBN缓冲溶液中(50mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，10mM CaCl2，0.05％Brij-35)体系下37
±
2℃孵育55～65min，使用4-20％SDS-PAGE验证。
[0023]为了提高准确性，上述MMP-2的梯度浓度为0、50、100、250、500ng/mL。
[0024]本申请可通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、透射电镜(TEM)对目的蛋白进行表征。
[0025]上本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的铁蛋白纳米粒子，其特征在于：通过连接序列将肿瘤穿透肽RGERPPR与铁蛋白C末端连接，肿瘤穿透肽RGERPPR暴露于铁蛋白的外部。2.如权利要求1所述的C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的铁蛋白纳米粒子，其特征在于：在连接序列中加入MMP-2酶切位点或突变MMP-2酶切位点序列，分别得到HFtn-MMP2-RGE和HFtn-mMMP2-RGE，其中，MMP2表示能够被MMP-2酶切的位点，序列为PLGLAG；mMMP2表示被突变的MMP-2酶切位点，突变后序列为ALGAAG；HFtn为由24个铁蛋白亚基组成的纳米蛋白笼。3.如权利要求2所述的C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的铁蛋白纳米粒子，其特征在于：C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的含MMP-2酶切位点的铁蛋白编码基因为SEQ ID No.1；C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的含突变MMP-2酶切位点的铁蛋白编码基因为SEQ ID No.2；C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的编码蛋白为SEQ ID No.3。4.如权利要求1-3任意一项所述的C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的铁蛋白纳米粒子，其特征在于：铁蛋白为人重链铁蛋白。5.权利要求1-4任意一项所述的C端修饰肿瘤穿透肽RGERPPR的铁蛋白纳米粒子的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)重组铁蛋白表达工程菌的构建：以HFtn编码基因为基础，在其3'端通过连接序列将肿瘤穿透肽RGERPPR与铁蛋白C末端连接，在连接序列中插入MMP-2酶切位点并克隆至质粒载体中，得到HFtn-MMP2-RGE质粒；将连接序列中插入突变MMP-2酶切位点并克隆至质粒载体中，得到HFtn-mMMP2-RGE质粒；将两种质粒分别转化至大肠杆菌感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性单克隆转化子，以获得目的重组铁蛋白表达工程菌；(2)重组铁蛋白的表达纯化：将表达目的重组铁蛋白表达工程菌以1
±
0.02％的接种比例接种于含有氨苄青霉素的培养基中，待菌液OD600值达到0.6-0.8时，加入IPTG诱导表达，离心收集沉淀，然后超声破碎沉淀，离心收集上清，再将上清水浴加热，再次离心，通过体积排阻色谱对目的重组铁蛋白进行多次纯化，得到目的重组铁蛋白HFtn-MMP2-RGE和HFtn-mMMP2-RGE。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，在连接序列中插入MMP-2酶切位点的编码基因为SEQ ID No.4：GGTGGTGGTGGTA...
【专利技术属性】
技术研发人员：张瑜，马原蒙，王飞，李迅，董亦馨，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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