工程化的葡糖基转移酶制造技术

本文公开了具有经修饰的氨基酸序列的葡糖基转移酶。此类工程化的酶合成具有降低的分子量的不溶性α

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化的葡糖基转移酶
[0001]本申请要求美国临时申请号62/640,708(2018年3月9日提交)和62/792,449(2019年1月15日提交)的权益，所述申请以其全文通过引用并入本文。


[0002]本公开属于酶催化领域。例如，本公开涉及具有经修饰的氨基酸序列的葡糖基转移酶。此类经修饰的酶合成具有降低的分子量的产物。
[0003]以电子方式递交的序列表的引用
[0004]所述序列表的官方副本经由EFS-Web以ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为20190306_CL6607WOPCT_SequenceListing.txt，创建于2019年3月6日，且具有约315千字节的大小，并与本说明书同时提交。包含在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用并入本文。

技术介绍

[0005]受到在多种应用中使用多糖的期望所驱动，研究人员已经探索了可生物降解的并且可以从可再生来源的原料经济地制造的多糖。一种这样的多糖是α-1，3-葡聚糖，其是特征在于具有α-1，3-糖苷键的不溶性葡聚糖聚合物。例如，已经使用从唾液链球菌(Streptococcus salivarius)分离的葡糖基转移酶制备了这种聚合物(Simpson等人，Microbiology[微生物学]141：1451-1460，1995)。还例如，美国专利号7000000公开了由酶促生产的α-1，3-葡聚糖制备纺成纤维。还研究了多种其他葡聚糖材料以用于开发新应用或增强的应用。例如，美国专利申请公开号2015/0232819公开了具有混合的α-1，3键和α-1，6键的几种不溶性葡聚糖的酶促合成。
[0006]虽然已经在使用葡糖基转移酶生产不溶性葡聚糖聚合物方面取得了这些进展和其他进展，但似乎很少关注调节由此类酶合成的不溶性葡聚糖产物的分子量。为解决这一技术差距，本文公开了具有经修饰的氨基酸序列的葡糖基转移酶，该葡糖基转移酶产生较低分子量不溶性葡聚糖产物。

技术实现思路

[0007]在一个实施例中，本公开涉及在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代的非天然葡糖基转移酶，其中所述非天然葡糖基转移酶合成包含1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖，并且所述不溶性α-葡聚糖的分子量低于由第二葡糖基转移酶合成的不溶性α-葡聚糖的分子量，所述第二葡糖基转移酶仅在一个或多个取代位置处不同于非天然葡糖基转移酶。
[0008]在另一个实施例中，本公开涉及包含编码如本文公开的非天然葡糖基转移酶的核苷酸序列的多核苷酸，任选地其中一个或多个调节序列可操作地连接到所述核苷酸序列，并且优选地其中所述一个或多个调节序列包含启动子序列。
[0009]在另一个实施例中，本公开涉及反应组合物，所述反应组合物包含水、蔗糖和如本文公开的非天然葡糖基转移酶。
[0010]在另一个实施例中，本公开涉及产生包含1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖的方法，所述方法包括：(a)使至少水、蔗糖和如本文公开的非天然葡糖基转移酶接触，从而产生包含1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖；以及(b)任选地，分离在步骤(a)中产生的不溶性α-葡聚糖。
[0011]在另一个实施例中，本公开涉及制备编码如本文公开的非天然葡糖基转移酶的多核苷酸序列的方法，所述方法包括：(a)鉴定编码亲本葡糖基转移酶的多核苷酸序列，所述亲本葡糖基转移酶(i)包含与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：4的位置55-960具有至少约40％同一性的氨基酸序列，并且(ii)合成包含1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖；以及(b)修饰步骤(a)中鉴定的多核苷酸序列以在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处取代亲本葡糖基转移酶的至少一个氨基酸，从而提供编码非天然葡糖基转移酶的多核苷酸序列，所述非天然葡糖基转移酶合成包含1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖，其中不溶性α-葡聚糖的分子量低于由亲本葡糖基转移酶合成的不溶性α-葡聚糖的分子量。
[0012]序列简述
[0013]表1.核酸和蛋白质SEQ ID号的汇总
b
[0014][0015]5”、“1-3和5”等。
[0022]术语“α-葡聚糖”、“α-葡聚糖聚合物”等在本文中可互换地使用。α-葡聚糖是包含通过α-糖苷键连接在一起的葡萄糖单体单元的聚合物。在典型的实施例中，本文的α-葡聚糖包含100％的α-糖苷键，或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的α-糖苷键。本文的α-葡聚糖聚合物的实例包括α-1，3-葡聚糖。
[0023]术语“聚α-1，3-葡聚糖”、“α-1，3-葡聚糖”、“α-1，3-葡聚糖聚合物”等在本文中可互换地使用。α-1，3-葡聚糖是包含通过糖苷键连接在一起的葡萄糖单体单元的聚合物，其中至少约50％的糖苷键是α-1，3。在某些实施例中，α-1，3-葡聚糖包含至少90％或95％的α-1，3糖苷键。本文的α-1，3-葡聚糖中的大部分或全部其他键典型地是α-1，6，尽管一些键还可以是α-1，2和/或α-1，4。
[0024]术语“糖苷键(glycoSidic linkage)”、“糖苷键(glycoSidic bond)”、“键”等在本文中可互换地使用，并且是指连接糖类化合物(低聚糖和/或多糖)内的糖单体的共价键。如本文所使用的，术语“α-1，3-糖苷键”是指通过相邻的α-D-葡萄糖环上的碳1和3将α-D-葡萄糖分子彼此连接的共价键的类型。如本文所使用的，术语“α-1，6-糖苷键”是指通过相邻的α-D-葡萄糖环上的碳1和6将α-D-葡萄糖分子彼此连接的共价键。本文的葡聚糖聚合物的糖苷键(glycosidic linkage)也可以称为“糖苷键(glucosidic linkage)”。本文中，“α-D-葡萄糖”将被称为“葡萄糖”。
[0025]本文的α-葡聚糖的糖苷键谱图可以使用本领域已知的任何方法确定。例如，可以使用采用核磁共振(NMR)光谱法(例如，
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C NMR和/或1H NMR)的方法确定键谱图。可以使用的这些和其他方法公开于例如，Food Carbohydrates：Chemistry，Physical Properties，and Applications[食品碳水化合物：化学、物理特性和应用](S.W.Cui编辑，第3章，S.W.Cui，Structural Analysis o本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种非天然葡糖基转移酶，所述非天然葡糖基转移酶在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Pro-550、Ser-553、Asn-557、Asn-558、Trp-571、Asn-573、Asp-575、Lys-578、Asn-581、Thr-585、或Gln-616相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代，其中所述非天然葡糖基转移酶合成包含1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖，并且所述不溶性α-葡聚糖的分子量低于由第二葡糖基转移酶合成的不溶性α-葡聚糖的分子量，所述第二葡糖基转移酶仅在一个或多个取代位置处不同于非天然葡糖基转移酶。2.如权利要求1所述的非天然葡糖基转移酶，所述非天然葡糖基转移酶在与SEQ ID NO：62的氨基酸残基Leu-513、Ser-553、Asn-573、Asp-575、Lys-578、或Gln-616相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代。3.如权利要求1所述的非天然葡糖基转移酶，其中：(i)在与氨基酸残基Leu-513相对应的位置处的氨基酸被Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr残基取代；(ii)在与氨基酸残基Pro-550相对应的位置处的氨基酸被Leu、Val、或Ile残基取代；(iii)在与氨基酸残基Ser-553相对应的位置处的氨基酸被Ala、Cys、Glu、Phe、His、Ile、Met、Asn、Arg、Thr、Val、或Tyr残基取代；(iv)在与氨基酸残基Asn-557相对应的位置处的氨基酸被Glu、Gln、Ile、Thr、Asp、Asn、Leu、Val、或Ser残基取代；(v)在与氨基酸残基Asn-558相对应的位置处的氨基酸被Asp或Glu残基取代；(vi)在与氨基酸残基Trp-571相对应的位置处的氨基酸被Val、Asp、Cys、Ile、Leu、Glu、或Ser残基取代；(vii)在与氨基酸残基Asn-573相对应的位置处的氨基酸被Ala、Asp、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Thr、Val、或Trp残基取代；(viii)在与氨基酸残基Asp-575相对应的位置处的氨基酸被Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、...

【专利技术属性】
技术研发人员：李友根，E，
申请(专利权)人：营养与生物科学美国四公司，
类型：发明
国别省市：