复合酶及其在制备麦角硫因中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，尤其涉及复合酶及其在制备麦角硫因中的应用。本发明专利技术提供了一种复合酶，该酶中包括L

【技术实现步骤摘要】
复合酶及其在制备麦角硫因中的应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及复合酶及其在制备麦角硫因中的应用。

技术介绍

[0002]麦角硫因(L-Ergothioneine,又名thiolhistidinebetaine)是一种含硫的L-组氨酸衍生物，它广泛存在于蘑菇、黑豆、红肉和燕麦等人类日常饮食中，人体一般通过具有高度特异性的麦角硫因转运蛋白来获取并保留在体内大部分细胞和组织中。麦角硫因是一种天然抗氧化剂，能有效清除体内活性氧和氮以保护细胞免受氧化凋亡损伤；此外大量研究表明麦角硫因也可保护皮肤免受UV-辐射，可有效降低眼疾、炎症性肠病、肝纤维化等疾病；因此在日常饮食中补充麦角硫因正变成一种潜在的预防上述疾病的选择。然而高昂的价格一直极大的限制了麦角硫因的进一步推广应用，因此开发一种简易的方法能规模化生产麦角硫因变得非常重要。
[0003]麦角硫因虽然分子量不大(C9H
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N3O2S,229.3)，但其含有的三甲基氨以及硫化的氮杂环官能团决定了该化合物功能及制备的特殊性。现今麦角硫因制备方法包含了化学合成法、发酵法以及酶催化法：
[0004]化学合成法是以L-组氨酸甲酯为起始原料，通过多次官能团选择性保护及脱保护才能间接实现氮杂环的硫化以及氨基的三甲基化(如图2所示，参考专利号:US7767826B2)，整个制备工艺非常繁琐，最终收率也低，环境成本高。
[0005]麦角硫因发酵生产研究历史悠久，如美国的Liu,pinghua通过植入Egt-1与EgtE两个麦角硫因合成基因到大肠杆菌(Escherichia coli)里，然后以L-组氨酸或三甲基组氨酸为原料发酵生产麦角硫因(参考专利：WO 2014/100752 Al)；英国的Steven A.van der Hoek通过改造酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),用普通的酵母培养基发酵生产麦角硫因(参考文献：Steven A.van der Hoek et al,Front.Bioeng.Biotech.2019,7,262)，然而由于麦角硫因发酵收率低(报道所实现的最高浓度接近克级每升)，因此现今无法实现规模化生产。
[0006]麦角硫因的体外酶催化制备也有相关报道，其采用的是生物体内麦角硫因Egt系列合成酶催化(如图2所示，参考文献：Florian P.Seebeck，JACS,2010,132,6632-6633)，然由于该路线较长，EgtD酶与EgtB酶转化效率低，以及腺苷蛋氨酸用量大等原因，酶合成制备麦角硫因成本居高不下。
[0007]可见，目前仍需进一步开发低成本高收率的工业化麦角硫因生产方法。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供复合酶及其在制备麦角硫因中的应用，该方法通过两步反应即可获得麦角硫因。
[0009]本专利技术还提供了一种复合酶，其包括：L-组氨酸甲基化酶、卤素甲基转移酶和三甲基组氨酸硫化酶。
[0010]本专利技术所述的复合酶中，所述L-组氨酸甲基化酶来自Mycobacterium smegmatismc或Chlorobium limicola；所述卤素甲基转移酶来自Chloracidobacterium thermophilum或Mycobacterium smegmatis；所述三甲基组氨酸硫化酶来自Escherichia coli或Chlorobium limicola。
[0011]在本专利技术实施例中，所述L-组氨酸甲基化酶具有如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列，所述卤素甲基转移酶具有如SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列，所述三甲基组氨酸硫化酶具有如SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列。
[0012]本专利技术中，来自Mycobacterium smegmatismc的L-组氨酸甲基化酶记为MsHisMT，来自Chlorobium limicola的L-组氨酸甲基化酶记为ClHisMT。来自Chloracidobacterium thermophilum的卤素甲基转移酶记为CtHaMT，来自Mycobacterium smegmatis的卤素甲基转移酶记为MsHaMT。来自Escherichia coli的三甲基组氨酸硫化酶记为EcHerS，来自Chlorobium limicola的三甲基组氨酸硫化酶记为ClHerS。
[0013]一些实施例中，所述复合酶由MsHisMT、CtHaMT和EcHerS组成。在该实施例中，MsHisMT与CtHaMT的比例为1000U：1500U。
[0014]另一些实施例中，所述复合酶由ClHisMT、CtHaMT和ClHerS组成。在该实施例中，ClHisMT与CtHaMT的比例为800U：800U。
[0015]另一些实施例中，所述复合酶由MsHisMT、MspHaMT和ClHerS组成。在该实施例中，MsHisMT与MspHaMT的比例为500U：1000U。
[0016]本专利技术所述复合酶在麦角硫因酶催化制备中的应用。
[0017]本专利技术还提供了麦角硫因的酶催化制备方法，其包括：
[0018]L-组氨酸经L-组氨酸甲基化酶、卤素甲基转移酶催化，获得三甲基组氨酸；然后经三甲基组氨酸硫化酶催化获得麦角硫因。
[0019]在有L-组氨酸反应获得三甲基组氨酸的步骤中，加入卤素甲基转移酶HaMT，该酶能利用碘甲烷快速转化腺苷高半胱氨酸(SAH)成腺苷蛋氨酸(SAM)。因此该步骤采用HaMT酶与HisMT酶组合，从而利用L-组氨酸甲基化酶HisMT与卤素甲基转移酶HaMT再生腺苷蛋氨酸将原料L-组氨酸一次性转化成三甲基组氨酸。
[0020]本专利技术所述的方法中，三甲基组氨酸的制备方法包括：在缓冲液中加入L-组氨酸、腺苷蛋氨酸、L-组氨酸甲基化酶和卤素甲基转移酶，然后滴加碘甲烷，pH7.0～9.0搅拌反应制得三甲基组氨酸。
[0021]一些实施例中，所述缓冲液为100mmol/L pH值为8.0的磷酸缓冲液；
[0022]所述加入至反应体系中L-组氨酸浓度为100mmol/L～200mmol/L；腺苷蛋氨酸浓度为0.8mmol/L～1.2mmol/L；L-组氨酸甲基化酶的浓度为500U/L～1000U/L；卤素甲基转移酶的浓度为800U/L～1500U/L；
[0023]所述滴加碘甲烷与腺苷蛋氨酸的摩尔比为(360～720):1。
[0024]所述滴加的时间为4h，所述滴加后再维持搅拌反应4h。
[0025]在获得三甲基组氨酸后，反应液以乙酸乙酯萃取，水相经1000～5000分子量超滤，取滤液为含有三甲基组氨酸的溶液。
[0026]其中，萃取步骤去除反应液中的碘甲烷和碘；超滤步骤去除反应液中的MsHisMT酶和CtHaMT酶。所得含有三甲基组氨酸的溶液以隔膜真空泵抽真空、补充N2的方式除去反应
溶液的O2，并最终用N2保护的方式封存。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.复合酶，其包括：L-组氨酸甲基化酶、卤素甲基转移酶和三甲基组氨酸硫化酶。2.根据权利要求1所述的复合酶，其特征在于，所述L-组氨酸甲基化酶来自Mycobacterium smegmatismc或Chlorobium limicola；所述卤素甲基转移酶来自Chloracidobacterium thermophilum或Mycobacterium smegmatis；所述三甲基组氨酸硫化酶来自Escherichia coli或Chlorobium limicola。3.根据权利要求1或2所述的复合酶，其特征在于，所述L-组氨酸甲基化酶具有如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列，所述卤素甲基转移酶具有如SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列，所述三甲基组氨酸硫化酶具有如SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列。4.权利要求1～3任一项所述的复合酶在麦角硫因酶催化制备中的应用。5.麦角硫因的酶催化制备方法，其特征在于，包括：L-组氨酸经L-组氨酸甲基化酶、卤素甲基转移酶催化，获得三甲基组氨酸；然后经三甲基组氨酸硫化酶催化获得麦角硫因。6.根据权利要求5所述的酶催化制备方法，其特征在于，其中三甲基组氨酸的制备方法包括：在缓冲液中加入L-组氨酸、腺苷蛋氨酸、L-组氨酸甲基化酶和卤素甲基转移酶，然后滴加碘甲烷，pH7.0～9.0搅拌反应制得三甲基组氨酸。7.根据权利要求6所述的酶催化制备方法，其特征在于，所述缓冲液为100mmol/L pH值为8.0的磷酸缓冲液；所述加入至L-组氨酸浓度为100mmol/L～200mmol/L；腺苷蛋氨酸浓度为0.8mmol/L～1.2mmol/L；L-组氨酸甲基化酶的浓度为500U/L～1000U/L；卤素甲基转移酶的浓度为800U/L～1500U/L；所述滴加碘甲烷与腺苷蛋氨酸的摩尔比为(360～720):1。8.根据权利要求5所述的酶催化制备方法，其特征在于，所述三甲基组氨酸硫化酶催化获得麦角硫因包括：加入三甲基组氨酸硫化酶和聚硫化钾，N2环境反应获得麦角硫因。9.根据权利要求8所述的酶催化制备方法，其特征在于，所述加入三甲基组氨酸硫化酶至浓度为600U/L～800...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄明汝，潘俊锋，刘建，
申请(专利权)人：深圳瑞德林生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：