一种用于抑制真菌生物膜的寡肽及其应用制造技术

本发明专利技术属于抗真菌药物技术领域，公开了一种用于抑制真菌生物膜的寡肽及其应用，用于抑制真菌生物膜的寡肽为细菌分泌产物，用于抑制真菌生物膜的形成；寡肽应用于抑制真菌生物膜的方法包括：细菌寡肽XIP人工合成；唾液收集

【技术实现步骤摘要】
一种用于抑制真菌生物膜的寡肽及其应用


[0001]本专利技术属于抗真菌药物
，尤其涉及一种用于抑制真菌生物膜的寡肽及其应用。

技术介绍

[0002]细菌的耐药性问题众所周知，真菌的耐药性问题却并未得到足够重视。抗真菌药物出现耐药性，给临床治疗侵袭性真菌感染带来极大的挑战。目前，临床上只有少数几类抗真菌药物可用，一旦出现耐药性就意味着许多常见的真菌感染变得难以治愈。此外，抗真菌药物开发时间长，投入巨大，上市后普遍价格昂贵，给患者带来严重的经济负担，在临床使用上也受到一定程度的限制。现有的药物不能完全满足临床治疗的需求，有关药物治疗的耐药性报道也逐渐增加，对真菌感染患者的治疗和康复构成了新的威胁，因此迫切需要加快抗真菌药物的研发进程。真菌的耐药性存在多种机制，在牙齿、上皮或人工装置(包括心脏瓣膜、留置导管)表面形成生物膜是其中一种普遍的耐药性机制。真菌生物膜的形成既增强真菌对宿主防御机制和药物的抵抗力，又能促进形成其它耐药机制，进一步增加其耐药性，因此研发以生物膜为靶标的抗真菌药物将是今后一段时间内抗真菌药物发展的重点。
[0003]口腔中存在着约700多种微生物，各种微生物之间通过复杂的相互作用维持口腔微生态的动态平衡。口腔微生物学的研究表明，定植于口腔的真菌与多种链球菌发生拮抗作用，例如白色念珠菌与变异链球菌共存时，白色念珠菌某些致病毒力特性被抑制，表明变异链球菌可能通过相互作用干预白色念珠菌的临床致病性。通过对真菌与其他微生物相互作用机制的研究，从与真菌发生拮抗作用的微生物中筛选其有效的代谢产物，用于抑制真菌生物膜形成与致病毒力表达，为开发新的临床抗真菌感染药物提供了重要来源与新的思路。
[0004]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的抗真菌药物种类少，耐药性逐渐增强，在临床治疗中的有效性面临挑战。
[0005]解决以上问题及缺陷的难度为：现有的研发思路下，抗真菌药物开发时间长，投入巨大，限制了新药开发的速度与上市后的临床使用。
[0006]解决以上问题及缺陷的意义为：从微生物相互拮抗的角度筛选潜在的抗真菌新药，可大大加快药物研发速度，降低研发费用，为临床抗真菌新药的开发提供了新的思路与更多的候选药物来源。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的问题，在对变异链球菌拮抗白色念珠菌作用机制的研究基础上，本专利技术提供了一种新的用于抑制真菌生物膜的寡肽及其应用，旨在帮助解决现有抗真菌药物耐药性日趋严重、缺乏新的有效候选药物的问题。XIP寡肽(氨基酸序列为GLDWWSL)是变异链球菌产生并分泌至胞外的细菌寡肽，研究基础表明，细菌来源的XIP寡肽对真菌生物膜形成具有明显的干扰作用。本专利技术通过人工合成XIP细菌寡肽，应用方法为在白色念珠
菌(真菌)生物膜形成过程中加入XIP寡肽，使用结晶紫染色方法定量检测XIP作用下的白色念珠菌生物膜形成情况。本专利技术通过使用以生物膜为靶标的的细菌寡肽作用于白色念珠菌生物膜，可以有效抑制白色念珠菌生物膜形成。
[0008]本专利技术是这样实现的，一种用于抑制真菌生物膜的寡肽，所述用于抑制真菌生物膜的寡肽为细菌分泌产物，用于抑制真菌生物膜；序列为GLDWWSL，分子量875.99；寡肽由变异链球菌分泌，对白色念珠菌的有效浓度为0.1μM。
[0009]本专利技术的另一目的在于提供一种所述寡肽用于抑制真菌生物膜的方法，所述该寡肽用于抑制真菌生物膜的方法包括：
[0010]第一步，细菌寡肽XIP人工合成；
[0011]第二步，唾液收集、包被培养板；
[0012]第三步，培养板接种真菌并加入XIP寡肽培养生物膜；
[0013]第四步，结晶紫染色法定量真菌生物膜生物量。
[0014]进一步，所述第一步细菌寡肽XIP人工合成方法包括：以固相合成法合成序列为GLDWWSL的XIP寡肽，纯度不低于98％。
[0015]进一步，所述第二步唾液收集、包被培养板的方法包括：
[0016]步骤一，收集唾液时，口腔健康的志愿者静坐5min，口内咀嚼5g石蜡，将唾液收集在离心管中；离心管在离心机中离心10min后收集上清液，使用0.22μm孔径滤器过滤获得刺激性唾液，于-20℃储存备用；
[0017]步骤二，使用96孔微量板作为培养板，在每孔中加入200μL刺激性唾液包被，放置在37℃恒温培养箱中过夜；取走刺激性唾液，使用PBS清洗孔板，晾干备用。
[0018]进一步，所述步骤一离心管在离心机中离心转速10000g，温度保持4℃。
[0019]进一步，所述第三步培养板接种真菌并加入XIP寡肽培养生物膜的方法包括：
[0020]步骤一，将合成的XIP粉末溶解在DMSO中，制备高浓度的母液，于-20℃储存备用；
[0021]步骤二，真菌接种于RPMI 1640培养基，置于37℃恒温二氧化碳培养箱培养；
[0022]步骤三，调整真菌培养液浓度为105CFU/mL，接种到唾液包被好的培养板中，每孔200μL；
[0023]步骤四，培养板每孔按比例加入制备的XIP母液，以同样比例的DMSO作为空白对照，每组设置三个平行样，每个平行样设置三个复孔；
[0024]步骤五，将培养板放置在37℃恒温二氧化碳培养箱培养24h。
[0025]进一步，所述步骤二的二氧化碳培养箱培养气体为5％CO2。
[0026]进一步，所述第四步结晶紫染色法定量真菌生物膜生物量的方法包括：
[0027]步骤一，将培养板中的培养液倒掉，PBS小心洗涤生物膜2次，晾干；
[0028]步骤二，每孔加入100μL甲醇固定生物膜15min，倒掉甲醇，使用PBS洗涤1次，晾干；
[0029]步骤三，每孔加入0.1％w/v结晶紫染液50μL，静置5min，倒掉结晶紫染液，使用PBS洗涤3次，晾干；
[0030]步骤四，每孔加入200μL 95％乙醇溶液，放置在摇床上；
[0031]步骤五，每孔吸取100μL乙醇萃取溶液到新的96孔微量板中，于分光光度计下测量OD
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的数值，此数值代表生物膜的生物量。
[0032]进一步，所述步骤四在300rpm摇床上放置30min。
[0033]本专利技术的另一目的在于提供一种使用所述用于抑制真菌生物膜的寡肽制备的抗菌药物。
[0034]结合上述的所有技术方案，本专利技术所具备的优点及积极效果为：本专利技术所用的XIP细菌寡肽结构简单，制备方便，以生物膜为特定作用靶标，应用于抑制真菌生物膜具有显著效果，有助于临床抗真菌感染开发新的候选药物。
附图说明
[0035]图1是本专利技术实施例提供的寡肽用于抑制真菌生物膜的方法流程图。
[0036]图2是本专利技术实施例提供的结晶紫染色法定量XIP寡肽作用下的白色念珠菌生物膜形成情况示意图。
[0037]图3是本专利技术实施例提供的扫描电子显微镜观察XIP寡肽作用下的白色念珠菌生物膜形貌示意图。
[0038]图4是本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于抑制真菌生物膜的寡肽，其特征在于，所述用于抑制真菌生物膜的寡肽为细菌分泌产物，用于抑制真菌生物膜；序列为GLDWWSL，分子量875.99；寡肽由变异链球菌分泌，对白色念珠菌的有效浓度为0.1μM。2.一种如权利要求1所述寡肽用于抑制真菌生物膜的方法，其特征在于，所述该寡肽用于抑制真菌生物膜的方法包括：第一步，细菌寡肽XIP人工合成；第二步，唾液收集、包被培养板；第三步，培养板接种真菌并加入XIP寡肽培养生物膜；第四步，结晶紫染色法定量真菌生物膜生物量。3.如权利要求2所述的寡肽用于抑制真菌生物膜的方法，其特征在于，所述第一步细菌寡肽XIP人工合成方法包括：以固相合成法合成序列为GLDWWSL的XIP寡肽，纯度不低于98％。4.如权利要求2所述的寡肽用于抑制真菌生物膜的方法，其特征在于，所述第二步唾液收集、包被培养板的方法包括：步骤一，收集唾液时，口腔健康的志愿者静坐5min，口内咀嚼5g石蜡，将唾液收集在离心管中；离心管在离心机中离心10min后收集上清液，使用0.22μm孔径滤器过滤获得刺激性唾液，于-20℃储存备用；步骤二，使用96孔微量板作为培养板，在每孔中加入200μL刺激性唾液包被，放置在37℃恒温培养箱中过夜；取走刺激性唾液，使用PBS清洗孔板，晾干备用。5.如权利要求4所述的寡肽用于抑制真菌生物膜的方法，其特征在于，所述步骤一离心管在离心机中离心转速10000g，温度保持4℃。6.如权利要求2所述寡肽用于抑制真菌生物膜的方法，其特征在于，所述第三步培养板接种真菌并加入XIP寡肽培养生...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书二页说明书四页附图二页，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：