同时检测DNA病毒和RNA病毒的病毒核酸检测方法技术

本发明专利技术提供同时检测DNA病毒和RNA病毒的病毒核酸检测方法。该病毒核酸检测方法包括以下步骤：S1：提供Cas12a蛋白、Cas13a蛋白、第一crRNA、第二crRNA和待测核酸样品的体系；S2：将体系与DNA荧光探针、RNA荧光探针混合反应；S3：对反应前后的荧光信号进行检测。Cas蛋白在与特异性crRNA形成复合物后，与病毒中靶向的互补DNA链或与互补RNA链结合进一步形成功能复合体，这些功能复合体的形成会释放出强大的非特异性剪切核酸单链的剪切活性，能够对DNA荧光探针或RNA荧光进行剪切，改变其荧光发光状态。通过这两类Cas蛋白的联用，实现对DNA病毒及RNA病毒的同时准确高效检测。及RNA病毒的同时准确高效检测。及RNA病毒的同时准确高效检测。

【技术实现步骤摘要】
同时检测DNA病毒和RNA病毒的病毒核酸检测方法


[0001]本专利技术涉及病毒检测
，尤其是涉及同时检测DNA病毒和RNA病毒的病毒核酸检测方法。

技术介绍

[0002]近些年来，由病毒造成的全球事件频繁发生。非洲猪瘟造成了全球生猪大面积死亡，伊波拉病毒的高度感染性使其在世界各地反复出现，而流感病毒则频繁地导致大范围人群及家禽致病。这些病毒传播途径简单、传播速度快，往往容易引起聚集性爆发事件，导致流行性疫病。针对这些病毒，医疗工作人员目前尚无长期有效的疫苗及治疗方法。因此，快速高效的病毒检测就成为了控制病毒传播扩散的有力手段。
[0003]在进行病原体的检测时，常常需要针对可能产生相似症状的不同种病毒进行检测以更好地区分。例如，发烧、头疼、乏力、嗓子疼等症状在EB病毒(DNA病毒)以及流感病毒(RNA病毒)造成的感染中都有可能出现，如果不能对其进行准确检测，可能会耽误患者的后续治疗工作。目前实践中最常用的病毒检测方法是聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)以及由此改进得到的其它检测方法。这些方法在进行检测时需要专业的技术人员和大量的血清样本，耗时较长，反应条件也相对苛刻。如果在面临上述情况、需要针对不同的DNA病毒和RNA病毒进行检测时，往往只能分别进行，其原因在于，不同类型的病毒的核酸的特性、长度和复杂程度都有所不同，如果同时对两类病毒进行检测可能会因假阳性等原因而使得结果的准确性较差。因此，有必要提供一种准确高效的能够同时检测DNA病毒和RNA病毒的病毒核酸检测方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种准确高效的能够同时检测DNA病毒和RNA病毒的病毒核酸检测方法。
[0005]第一方面，本专利技术的一个实施例提供了一种同时检测DNA病毒和RNA病毒的病毒核酸检测方法，该病毒核酸检测方法包括以下步骤：
[0006]S1：提供Cas12a蛋白、Cas13a蛋白、第一crRNA、第二crRNA和待测核酸样品的体系；
[0007]S2：将体系与DNA荧光探针、RNA荧光探针混合反应，检测反应前和反应后的荧光信号；
[0008]其中，第一crRNA用于与Cas12a蛋白形成第一复合物，第一复合物特异性识别DNA病毒；第二crRNA用于与Cas13a蛋白形成第二复合物，第二复合物特异性识别RNA病毒。
[0009]本专利技术实施例的病毒核酸检测方法至少具有如下有益效果：
[0010]CRISPR/Cas系统是一种通过Cas蛋白与相应crRNA结合后特异性识别并结合靶向DNA或RNA序列，对其进行剪切或修改的基因编辑技术。本方案采用的Cas12a蛋白在与特异性crRNA形成复合物后，与DNA病毒中靶向的互补DNA链结合进一步形成功能复合体Cas12a-crRNA-DNA，该功能复合体的形成会释放出强大的非特异性剪切ssDNA的剪切活性，能够对
DNA荧光探针进行剪切，改变其荧光发光状态。同样的，Cas13a蛋白具有RNA介导的RNA酶切活性，在与特异性crRNA及RNA病毒中靶向的互补RNA链结合形成功能复合体Cas13a-crRNA-RNA后，产生的非特异剪切ssRNA的剪切活性会对RNA荧光探针进行剪切从而改变其荧光发光状态。荧光发光状态的改变程度与对应的功能复合体的量呈正相关，因而可以通过这两类Cas蛋白的联用，实现对DNA病毒及RNA病毒的同时检测。而且，根据DNA荧光探针和RNA荧光探针的发光强度的改变，能够准确地测定样品中DNA病毒和RNA病毒的含量。Cas12a和Cas13a蛋白所具有的非特异性剪切功能可无差别剪切其周围的非特异单链DNA荧光探针和RNA荧光探针，这为检测信号的放大提供了有利条件，提高了信噪比。crRNA间隔区序列对靶向DNA或RNA片段的特异性识别则进一步提高了两类病毒同时检测的准确性。
[0011]根据本专利技术的一些实施例的病毒核酸检测方法，体系还包括缓冲液，缓冲液中钠离子的终浓度为40～60mM，镁离子的终浓度为4～8mM。Cas12a蛋白和Cas13a蛋白的反应体系相对独立，不同的反应条件会导致Cas12a蛋白和Cas13a蛋白在联用时处于不同的反应活性状态，进而影响病毒核酸的检测效果。而当体系中的钠离子和镁离子处于上述浓度时，两种反应系统同时处于较佳的反应条件，检测体系的效率和准确性更好。
[0012]根据本专利技术的一些实施例的病毒核酸检测方法，缓冲液中钠离子的终浓度为42～58mM，镁离子的终浓度为4.4～7.6mM；优选为钠离子的终浓度为44～56mM，镁离子的终浓度为4.8～7.2mM；优选为钠离子的终浓度为46～54mM，镁离子的终浓度为5.2～6.8mM；优选为钠离子的终浓度为48～52mM，镁离子的终浓度为5.6～6.4mM。
[0013]根据本专利技术的一些实施例的病毒核酸检测方法，缓冲液以终浓度计，包括如下组分：40～60mM的NaCl、15～25mM的Tris、4～8mM的MgCl2、50～150μg/mL的BSA，pH为7.3～7.7。Tris(三羟甲基氨基甲烷)能够维持核酸稳定性、避免核酸降解、提高核酸纯度，而BSA(牛血清白蛋白)则能够保持酶活。整个体系中缓冲液满足上述条件时可以使两种蛋白同时处于高效激活状态，具有良好的生物反应活性，能够准确检测样品中DNA病毒和RNA病毒的含量。
[0014]根据本专利技术的一些实施例的病毒核酸检测方法，荧光信号通过TIRFM(Total Internal Reflection Fluorescent Microscope，全内反射荧光显微镜)进行检测。传统的全液态CRISPR/Cas检测在无核酸扩增的情况下，灵敏度最高只能达到pM；而如果结合核酸扩增的反应，其中部分信息会出现失真，导致假阳性或假阴性的结果。TIRFM的成像面积较小，可以达到微米级别，低背景、高分辨率的特点使其可以进一步提高信噪比，使得信号的微小变化都可以被观测，极少量的病毒核酸激发的探针剪切都可以被检测出来，从而获得更高的灵敏度。
[0015]根据本专利技术的一些实施例的病毒核酸检测方法，检测荧光信号的方法包括如下步骤：
[0016]通过全内反射荧光显微镜获取反应前后的图像；
[0017]根据图像提取不同波段的荧光强度；
[0018]根据荧光强度分析待测核酸样品中DNA病毒和RNA病毒的浓度。
[0019]根据本专利技术的一些实施例的病毒核酸检测方法，其中的不同波段是指分别对应DNA荧光探针和RNA荧光探针的荧光波段。显然，为了获得较好的分析图像，DNA荧光探针和RNA荧光探针的荧光波段不同。
[0020]根据本专利技术的一些实施例的病毒核酸检测方法，采用机器学习技术执行分析。具体采用的机器学习技术可以是分类树、判别分析、K最近邻算法、朴素贝叶斯、支持向量机、深度学习或卷积神经网络等。通过机器学习技术对图像中不同波段的荧光强度进行更准确的分析从而得出相应的病毒浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.同时检测DNA病毒和RNA病毒的病毒核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：提供Cas12a蛋白、Cas13a蛋白、第一crRNA、第二crRNA和待测核酸样品的体系；S2：将所述体系与DNA荧光探针、RNA荧光探针混合反应，检测反应前和反应后的荧光信号；其中，所述第一crRNA用于与所述Cas12a蛋白形成第一复合物，所述第一复合物特异性识别所述DNA病毒；所述第二crRNA用于与所述Cas13a蛋白形成第二复合物，所述第二复合物特异性识别所述RNA病毒。2.根据权利要求1所述的病毒核酸检测方法，其特征在于，所述体系还包括缓冲液，所述缓冲液中钠离子的终浓度为40～60mM，镁离子的终浓度为4～8mM。3.根据权利要求2所述的病毒核酸检测方法，其特征在于，所述缓冲液以终浓度计，包括如下组分：40～60mM的NaCl、15～25mM的Tris、4～8mM的MgCl2、50～150μg/mL的BSA，pH为7.3～7.7。4.根据权利要求1所述的病毒核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：何倩，秦培武，于冬梅，董宇涵，陈群，袁曦，
申请(专利权)人：清华伯克利深圳学院筹备办公室，
类型：发明
国别省市：