本发明专利技术公开一种快速检测轮状病毒的RDA方法及试剂盒，包括特异性引物对以及RDA荧光标记探针，以实现对轮状病毒（RV）进行安全、特异、灵敏、简便的检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。此方法提供的试剂盒可省去核酸提取步骤，并在37～42℃恒温条件下、20min内实现轮状病毒的检测，特异性为100％，非常适用于现场快速检测。与普通PCR方法相比，RDA荧光法是在恒温下反应，不需变温，不需复杂仪器，而且反应时间短。因此，本发明专利技术的方法及其试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、成本低廉等特点，为轮状病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种快速检测轮状病毒的RDA方法及试剂盒
[0001]本专利技术属于分子生物学
更具体地，涉及一种基于RDA荧光法检测技术检测轮状病毒核酸的引物对、探针及相关试剂盒。
技术介绍
[0002]轮状病毒(Rotavirus，简称RV)是一种双链核糖核酸病毒，属于呼肠孤病毒科。轮状病毒总共有七种，以英文字母编号为A、B、C、D、E、F与G。其中能够造成人类腹泻的轮状病毒(RV)只有A、B、C组，A组是最为常见的一种。A组轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一，其主要感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻。轮状病毒每年在夏秋冬季流行，感染途径为粪－口途径，轮状病毒感染从无症状、轻微发病到严重发病，严重时发生致命性胃肠炎、脱水及电解质平衡。其中急性胃肠炎的临床表现为症状包括发烧、呕吐、腹痛以及无血色水样腹泻，症状可持续3～9天。几乎世界上每个大约五岁的小孩都曾感染过轮状病毒至少一次。
[0003]目前，我国对轮状病毒病的经典检测方法是电镜技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金法等。电镜技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 等方法要求具备特殊设备和专业技术人才，然而这些条件在基层社区诊疗机构往往难以获得，影响了轮状病毒的早期发现和预防。目前仍然缺乏适合基层检验的简单便宜自动化程度高的轮状病毒检测试剂盒。
[0004]随着体外核酸恒温扩增的悄然兴起，传统扩增技术的局限性有所改变，在过去的十年中，使核酸体外扩增变得更加简单和方便的一些等温核酸扩增技术已得到快速发展，如LAMP(环介导核酸扩增技术)、HDA(解旋酶依赖等温核酸扩增技术)等均可在等温条件下扩增病毒核酸。这些技术只需要温度控制装置来保持一个恒定反应温度，就可以实现高效的核酸扩增，从而得以摆脱对精密控制温度变化的PCR仪的依赖。若能在常温条件下实现核酸的扩增，将进一步使核酸扩增技术简单化，并有利于此类技术更广范围的应用。及时准确地发现传染病疫情对于疾病的防治和疫情的控制具有重要意义，因此研究和开发一种能在基层诊疗机构使用，在常温下快速检测核酸的试剂盒非常有必要。
技术实现思路
[0005]本专利技术要解决的技术问题是克服现有轮状病毒检测技术的缺陷和不足。研究得到一种轮状病毒(RV)RDA荧光法检测试剂盒，实现轮状病毒的快速检测，在检测RV的整个过程中，从样本处理到结果完成，仅需20-30min，大大缩短了常规的检测时间，提高检测效率。
[0006]本专利技术目的在于，提供优选后的检测轮状病毒的探针及引物对。
[0007]所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
[0008]优选地，采用两种方案设计RDA荧光标记探针，第一种方案为：在靶标区域选择 25-35bp保守序列为探针序列，5
’
端标记发光基团，3
’
端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基(THF)替代。第二种方案为：探针长度为46-52个核甘酸，其中至少30
个位于THF位点的5
’
端，另外至少15个位于其3
’
端。通过系列实验比对，两种探针设计方案均适用于RDA荧光检测方法，在检测的灵敏度和特异性上无明显差异。
[0009]所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1的探针，其5
’
端标记发光基团，3
’
端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基(THF)替代，其具体信息如下：
[0010]RV-P1(SEQ ID NO.1)：
[0011]5’-
FAM-CAACC[THF]CAGCTCTTGAGAATATGGGAATAG-BHQ1-3
′
[0012]所述核苷酸序列为SEQ ID NO.2的探针，其5
’
端第30位碱基T标记FAM或者其他发光基团，第32位碱基用四氢呋喃残基(THF)替代，第33位碱基标记BHQ1或者其他淬灭基团，3
’
端进行C3-spacer阻断修饰，其具体信息如下：
[0013]RV-P2(SEQ ID NO.2)：
[0014]5-GAAGCTGCAGTTGTAGCTGCAACCTCAGC[FAM-dT]C[THF][BHQ1-dT]GAGA ATATGGGAATAG[C3-spacer]-3
’
[0015]所述引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述靶标序列如 SEQ ID NO.5所示，其具体信息如下：
[0016]RV-F1(SEQ ID NO.3)：5
’-
TGGAGTCTACGCAACAGATGGCCGTC-3
’
；
[0017]RV-R1(SEQ ID NO.4)：5
’-
ACTCTAGAATATATATCCTGATAATCA-3
’
。
[0018]本专利技术另一个目的在于，提供一种基于恒温扩增技术的检测轮状病毒的试剂盒。
[0019]所述试剂盒包括核酸提取试剂、恒温扩增反应模块、阳性对照和阴性对照，以及所述的探针及所述的引物。
[0020]优选地，所述恒温扩增反应模块为恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂。
[0021]优选地，所述恒温扩增反应混合试剂为RPA或重组酶依赖型扩增技术 (Recombinase-dependent amplification，RDA)恒温扩增反应混合试剂。
[0022]本专利技术另一个目的在于，提供一种基于重组酶依赖型扩增技术(Recombinase-dependent amplification，RDA)的检测轮状病毒的试剂盒。
[0023]重组酶依赖型扩增技术(Recombinase-dependent amplification，RDA)通过以下技术方案实现：
[0024]本专利技术利用生物信息学方法，对批量的蛋白结构进行分析模拟和高通量虚拟筛选，并通过大量的生物学实验验证，最终找到了新的稳定性高的重组酶组合。具体地，本专利技术开发了一种新的重组酶组合为重组酶KX和辅助蛋白KY，所述重组酶KX，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，辅助蛋白KY的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0025]所述重组酶KX可以替代RPA反应中重组酶UvsX或RecA使用，所述KY蛋白可以替代RPA反应中UvsY蛋白使用。
[0026]重组酶KX与T4 UvsX蛋白序列同源性为50％(201/395)。基于此重组酶组合，本团队开发了一种新的稳定性高、特异性强的重组酶依赖型扩增技术(RDA)的检测方法和检测系统。本专利技术中重组酶KX的制备工艺简单，产量和稳定性大幅提高，量产成本低。且基于此重组酶组合开发的扩增技术，所需引物短(18-30bp)，对本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于检测轮状病毒的探针，其特征在于，所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .2所示。2.如权利要求1所述的检测轮状病毒的探针，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID NO .1的探针，其5
’
端标记发光基团，3
’
端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代。3.如权利要求1所述的检测轮状病毒的探针，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID NO .2的探针，其5
’
端起第30位碱基T标记发光基团，第32位碱基用四氢呋喃残基（THF）替代，第33位碱基标记淬灭基团，3
’
端进行C3-spacer阻断修饰。4.一组用于检测轮状病毒的靶标序列、引物对及探针，其特征在于，所述探针为权利要求1-3 任一所述的探针，所述引物对核苷酸序列如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示，所述靶标序列如SEQ ID NO .5所示。5.一种检测轮状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸提取试剂、恒温扩增反应模块、阳性对照和阴性对照，以及权利要求1-3任一所述的探针及权利要求4所述的引物对。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的恒温扩增反应模块为RDA或RPA恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂；所述RDA恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的重组酶KX。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的RDA恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢婵芳，刘华勇，黄嘉恩，陈翀，
申请(专利权)人：广州普世君安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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