一种快速检测猪瘟病毒（CSFV）的RDA方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开一种快速检测猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）的RDA方法及试剂盒，包括特异性引物对以及RDA荧光标记探针，以实现对猪瘟病毒（CSFV）的安全、特异、灵敏、简便的检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。本发明专利技术中提供的试剂盒可省去核酸提取步骤，在恒温条件下20min内实现猪瘟病毒（CSFV）的检测，特异性为100％，与普通PCR方法相比，RDA荧光法在恒温下反应，不需变温，不需复杂仪器，而且反应时间短，适用于现场快速检测。本发明专利技术的方法及其试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、成本低廉等特点，可为猪瘟病毒（CSFV）现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
35bp保守序列为探针序列，5
’
端标记发光基团，3
’
端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代。第二种方案为：探针长度为 46-52 个核甘酸，其中至少 30 个位于 THF 位点的 5
’
端，另外至少 15 个位于其 3
’
端。通过系列实验比对，两种探针设计方案均适用于RDA荧光检测方法，在检测的灵敏度和特异性上无明显差异。
[0008]所述核苷酸序列为SEQ ID NO .1的探针，其5
’
端标记发光基团，3
’
端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代，其具体信息如下：CSFV-P1（SEQ ID NO .1）：5
’-
FAM-GAAGA[THF]TGGCCCCTATGCCGTGCAGACCCA-BHQ1
ꢀ-3′
所述核苷酸序列为SEQ ID NO .2的探针，在5
’
端起第36位碱基T标记FAM或者其他发光基团，第37位碱基用四氢呋喃残基（THF）替代，第38位碱基标记BHQ1或者其他淬灭基团，3
’
端进行C3-spacer阻断修饰，其具体信息如下：CSFV-P2（SEQ ID NO .2）：5
’-
GTTAAGGTGCACGCATTGGATGGAAGACTGGCCCC[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]GCCGTGCAGACCCA[C3-spacer]ꢀ-3’
所述引物对核苷酸序列如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示，所述靶标序列如SEQ ID NO .5所示，其具体信息如下：CSFV-F1（SEQ ID NO .3）： 5
’-
GCACTGAAGGAGAACACGAGTGCTTGATC
ꢀ-3’
；CSFV-R1（SEQ ID NO .4）： 5
’-
TAGTTGAAAGTGCAGGAAGTTTTCCTTAC-3
’
。
[0009]本专利技术另一个目的在于，提供一种基于恒温扩增技术的检测猪瘟病毒的试剂盒。
[0010]所述试剂盒包括核酸提取试剂、恒温扩增反应模块、阳性对照和阴性对照，以及所述的探针及所述的引物。
[0011]优选地，所述恒温扩增反应模块为恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂。
[0012]优选地，所述恒温扩增反应混合试剂为RPA或重组酶依赖型扩增技术（Recombinase-dependent amplification，RDA）恒温扩增反应混合试剂。
[0013]本专利技术另一个目的在于，提供一种基于重组酶依赖型扩增技术（Recombinase-dependent amplification，RDA）的检测猪瘟病毒的试剂盒。
[0014]重组酶依赖型扩增技术（Recombinase-dependent amplification，RDA）通过以下技术方案实现：本专利技术利用生物信息学方法，对批量的蛋白结构进行分析模拟和高通量虚拟筛选，并通过大量的生物学实验验证，最终找到了新的稳定性高的重组酶组合。具体地，本专利技术开发了一种新的重组酶组合为重组酶KX和辅助蛋白KY，所述重组酶KX，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，辅助蛋白KY的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0015]所述重组酶KX可以替代RPA反应中重组酶UvsX或RecA使用，所述KY蛋白可以替代RPA反应中UvsY蛋白使用。
[0016]重组酶KX与T4 UvsX 蛋白序列同源性为50%（201/395）。基于此重组酶组合，本团队开发了一种新的稳定性高、特异性强的重组酶依赖型扩增技术（RDA）的检测方法和检测系统。本专利技术中重组酶KX的制备工艺简单，产量和稳定性大幅提高，量产成本低。且基于此重组酶组合开发的扩增技术，所需引物短（18-30bp），对靶标序列的长度要求低，适用性广。进一步的，该技术对核酸靶标序列的检测特异性好、灵敏度高，可在25-42℃的恒温条件下
ng/μL、单链结合蛋白gp32 100-1000 ng/μL、链置换DNA聚合酶3-100 ng/μL、核酸外切酶30~200U、肌酸激酶0.1-0.8 mg/ml、磷酸肌酸25-75 mM、Tris缓冲液20-100mM、PEG2.5%-10%、醋酸钾或醋酸钠0-150 mM、dATP 1-5 mM、dNTPs 150-600 nM each、DTT 1-12 mM、探针150nM-600nM、引物对150-600nM。
[0031]优选地，Tris-缓冲液为Tris-tricine。
[0032]优选地，Tris
-ꢀ
tricine的浓度为100mM。
[0033]所述核酸提取试剂包括Buffer A、Buffer B。Buffer A为样本裂解液，含有Tris-HCL缓冲体系、NaOH、SDS、EDTA、异硫氰酸胍、Tween80、曲拉通；Buffer B含有Tris缓冲体系、氯化钾、氯化镁；阳性对照为含有猪瘟病毒（CSFV）的靶标基因质粒，阴性对照为空载体pUC57质粒。
[0034]本专利技术再一个目的在于，提供一种基于重组酶依赖型扩增技术的检测猪瘟病毒的检测方法。
[0035]所述检测方法包括以下步骤：提取待测样品的提取待测，以待测样品的核酸为模板，在猪瘟病毒的引物对、探针及RDA冻干粉试剂、Buffer A和Buffer B存在下进行实时荧光RDA反应，根据实时荧光RDA扩增曲线分析待测样品；其中所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .2所示; 其中反应温度为25-42℃，反应时间大于10分钟。
[0036]优选的，包含以下步骤：1）样本处理将20μL Buffer A和5μL 阳性对照/阴性对照/待检样本（猪口鼻分泌物/血液/组织）震荡混匀，室温静置10-15min；2）体系配制及检测加入25μL Buffer B，震荡混匀后将50μL混合液加入RDA恒温扩增反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测；反应程序为：39℃ 1分钟，30个循环，每分钟采集荧光信号，30min完成检测；3）结果判定按反应体系产生的荧光值达到阈值的时间即阈值时间(Time Threshold，Tt)为进行结果判读。
[0037]①
阳性对照：有典型的扩增曲线出现，Tt值<25，为有效结果；
②
阴性对照：无扩增曲线出现，或Tt值≥30，为有效结果；
③
被检样本：a.若Tt值<25，判断为阳性；b.若Tt值≥30，判断为阴性；c.若25≤Tt值<30，判为可疑，需重复检测进行确认；再次检测结果仍然是25≤Tt值<30，应参照阴性对照Tt值，若阴性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测检测猪瘟病毒（CSFV）的探针，其特征在于，所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .2所示。2.如权利要求1所述的检测猪瘟病毒的探针，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID NO .1的探针，其5
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端标记发光基团，3
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端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代。3.如权利要求1所述的检测猪瘟病毒的探针，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID NO .2的探针，其5
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端起第36位碱基T标记发光基团，第37位碱基用四氢呋喃残基（THF）替代，第38位碱基标记淬灭基团，3
’
端进行C3-spacer阻断修饰。4.一组用于检测猪瘟病毒的靶标序列、引物对及探针，其特征在于，所述探针为权利要求1-3 任一所述探针，所述引物对核苷酸序列如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示，所述靶标序列如SEQ ID NO .5所示。5.一种检测猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸提取试剂、恒温扩增反应模块、阳性对照和阴性对照，以及权利要求1-3任一所述的探针及权利要求4所述的引物对。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的恒温扩增反应模块为RDA或RPA恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂；所述RDA恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的重组酶KX。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的RDA恒温扩增反应混合试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘华勇，文荻琛，陈翀，
申请(专利权)人：广州普世君安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：